Genética inversa (a veces denominado clonado posicional) Análisis Genético GENOTIPO FENOTIPO Genética inversa (a veces denominado clonado posicional) Aislamiento de variantes fenotípicas Análisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicas Análisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretos Análisis microscópico Análisis del DNA Genética molecular aplicada: usa los principios del conocimiento de la estructura y función del DNA para investigar la base del fenotipo controlado por un genotipo determinado en condiciones normales y patológicas.

FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

SÍNTESIS DE DNA: REPLICACIÓN

SÍNTESIS DE RNA Y PROTEÍNAS: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

COMPLEMENTARIEDAD Y ESTRUCTURA TRI-D DEL DNA

Factores de transcripción: regulan la iniciación de síntesis de RNA por unión a secuencias de DNA específicas en los promotores

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C)

RENATURALIZACIÓN DEL DNA Temperatura Fuerza iónica Concentración de DNA Tiempo de reacción Agentes desnaturalizantes: Formamida Urea

ENZIMAS METABÓLICOS DEL DNA EN APLICACIONES Enzimas de restricción Ligasas DNA y RNA polimerasas Nucleasas

Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas BamHI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN

LIGASAS: formación del enlace fosfo-di-éster

EXTRACCIÓN DE DNA Homogenización tejido (Dodecil sulfato sódico SDS; Ác. Etilendiaminotetraacético EDTA; Proteinasa K) Eliminación proteínas (Phenol; Cloroformo) Eliminación RNA (RNAasa) Precipitación (Etanol; Isopropanol en presencia de Na+) Bromuro de metil-trimetil-amonio CTAB

EXTRACCIÓN DE RNA DEPC: Dietil pirocarbonato N-Lauril Sarcosina Mercaptoetanol

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CsCl

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Xileno de cianol 5 Kb Azul de bromofenol 0.5 Kb

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Acrilamida [CH2=CHCONH2]n Metilen-bis-acrilamida (CH2=CHCONH2)2CH2 En presencia de Persulfato amónico y TEMED (N.N,N’, N’ tetrametiletilendiamina)

HIBRIDACIÓN DE SOUTHERN 1. NaOH 1N 2. Tris buffer 3. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)

HIBRIDACIÓN NORTHERN

SECUENCIACIÓN DE DNA

KARY MULLIS Y LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Dos cebadores (oligonucleótidos cortos de DNA de cadena simple) utilizados para amplificar un segmento definido de DNA genómico. Premio Nobel 1993

Ventajas de la PCR: especificidad y sensibilidad

MECANISMO Y COMPONENTES DE LA PCR DNA a amplificar (diana) primers (18-25 nts) DNA polimerasa termoestable dNTPs

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Desnaturalización Hibridación primers Extensión (síntesis DNA)

Producción PCR = (cantidad DNA inicial) x (1 + % eficiencia) nº ciclos Eficiencia: % de conversión de DNA molde a producto por ciclo P. ej. con una eficiencia del 70% se obtiene 1 µg a partir de 1 pg en unos 26 ciclos CICLOS COPIAS 1 2 2 4 4 16 10 1,024 15 32,768 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824

POLIMERASAS TERMOESTABLES Pol termoestables: activas despues de repetidamente a 95ºC óptimo a 75ºC Taq: Thermus aquaticus Tli: Thermococcus litoralis Pfu: Pyrococcus furiosus Tth: Thermus thermophilus

DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR Longitud de los primers (usualmente 18-24 nts) Temperaturas de fusión Tm (usualmente 44-55% G-C) No complementariedad entre los dos primers en los extremos 3’ (problema de dímeros de primer) No lazos intracatenarios (carecer de secuencias palindrómicas) Distancia entre primers (ideal entre 150-500 pb pero hasta 20 Kb)

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE HIBRIDACIÓN EN LA PRODUCTIVIDAD, SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

CONDICIONES DE LA PCR OPTIMIZABLES

RT-PCR: OBTENCIÓN DE RNAm

SÍNTESIS DE DNAc Síntesis de DNAc primera cadena requiere: RNAm dNTPs primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen) Transcriptasa reversa rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante) RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves) RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)

PRIMERS PARA LA SÍNTESIS DE LA PRIMERA CADENA

SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA USANDO “AUTOPRIMING”

SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA USANDO RNAasaH

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERA CON TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR) Combina la reacción de formación de DNAc y la amplificación por PCR. Puede ser de un solo enzima (rTth) o en dos reacciones (primero usando p. ej. AMV-RT y después Taq polimerasa para amplificar el DNAc.

APLICACIONES BÁSICAS DE LA RT-PCR RACE: Amplificación rápida de extremos de DNAc RT-PCR cuantitativa Aislamiento de transcritos que están presentes a diferentes niveles en dos poblaciones de RNAm “differential display” “suppresion substraction hybridization”

PROTOCOLO PARA LA RT-PCR RACE

PCR CUANTITATIVA 1: RT-PCR COMPETITIVA USANDO UN RNA “MIMÉTICO”

RT-PCR CUANTITATIVA 2: EN “TIEMPO REAL”

TaqMan probe used in Real Time PCR sample amplification CT = cycle at which the observed fluorescence is 10-fold above background (10x amplification).

DETECCIÓN DE GENES CON EXPRESIÓN DIFERENTE RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

“Suppression subtraction hybridization” (SSH)