Huella Genética o “Fingerprinting” Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Huella Genética o “Fingerprinting” Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

Huella genética o “Fingerprinting” de ADN Temas Cubiertos • Digestión de las muestras de ADN con enzimas de restricción Introducción a la base teórica de Huella Genética o “Fingerprinting” de ADN Electroforesis de geles de agarosa Análisis e interpretaciones de los resultados

Aplicaciones al mundo real de Huella genética o “Fingerprinting” de ADN • Escena del crimen • Relación entre humanos • Paternidad • Relación entre animales Estudios antropológicos Estudios de organismos que causan enfermedades Identificación de alimentos Restos Humanos Monitoreo de transplantes

El kit de Huella genética o “Fingerprinting” de ADN Forense Puede ayudar a enseñar: • La estructura de ADN • Análisis de patrones de restricción de ADN Electroforesis en gel de agarosa Determinación de tamaño Simulación de “Fingerprinting” de ADN forense real

Huella Genética Resumen de los Procedimientos

Huella Genética Procedimiento Primera Parte

Huella Genética Procedimiento Segunda Parte

Huella Genética Procedimiento Tercera Parte

Equipo de Electroforesis de Agarosa Bio-Rad PowerPac™ Junior PowerPac™ Basic • Cubetas de Electroforesis • Fuentes de Electricidad • Geles de agarosa preparados PowerPac™ HC PowerPac™ Universal PowerPac™ 3000 Mini-Sub® Cell GT Wide Mini-Sub Cell GT

Los Cromosomas están Compuestos de ADN y Proteínas llamadas Histonas.

El Estudio de Cariotipo Ayuda a Identificar Anormalidades Genéticas

El ADN existe enrollado apretadamente alrededor de proteínas llamadas Histonas, formando estructuras denominadas cromosomas que se encuentran en el núcleo.

Modelo del ADN El ADN está compuesto de: fosfatos, azúcares de cinco carbonos llamadas deoxirribosas, y cuatro tipos de bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina, guanina).

Ácido Desoxirribonucleico (ADN)

ADN Representación Esquemática 5’ fosfato ADN Representación Esquemática O CH2 P Base OH Azúcar Sólo se muestra una cadena de ADN. 3’ hidróxido

Los Genes consisten de exones y de intrones Los Genes consisten de exones y de intrones. Los exones son secuencias de ADN que se expresan en la célula. Los intrones son secuencias de ADN que no se expresan en la célula.

Los Intrones son removidos del ARN durante el proceso de Transcripción

Enzimas de Restricción - Enzimas que cortan ADN virus • Evolucionadas por bacterias para protegerse contra infecciones virales. • Son endonucleasas, cortan en el interior de las hebras del ADN. • Se conocen más de 3,000 enzimas de restricción. bacteria

Sitio de Reconocimiento de la Enzima de Restricción Sitio de restricción Secuencia Palindrómica • Cada enzima digiere (corta) ADN en una secuencia específica, o sitio de restricción. • Las enzimas reconocen de 4 a 6 pares de bases organizadas en secuencias palindrómicas (Ej. GAATTC). Fragmento 1 Fragmento 2

Extremos Sobresalientes 5’ o 3’ La enzima corta aquí • Algunas enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 5’ (cinco primo), como la mostrada aquí. • Otras enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 3’ (tres primo).

Enzimas de Restricción Comunes EcoRI – Eschericha coli – Extremos Sobresalientes 5’ • EcoRI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 5’. PstI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 3’. Pstl – Providencia stuartii – Extremos Sobresalientes 3’

Extremos Parejos AluI – Arthrobacter luteus – Extremos Parejos • Existen otras enzimas de restricción que generan extremos parejos; es decir, extremos que no tienen porciones sobresalientes. Ejemplos: AluI y HaeIII HaeIII – Haemophilus aegyptius – Extremos Parejos

Otros Componentes en la Reacción de la Digestión del ADN Búfer Restricción permite las condiciones óptimas para la reacción • NaCI proporciona la concentración correcta de iónes • Tris-HCI proporciona el pH correcto • Mg2+ es un co-factor enzimático

Temperatura de la Digestión del ADN ¿Por qué incubamos a 37°C? • La temperatura del cuerpo es la temperatura óptima para éstas y otras enzimas. ¿Qué pasa si la temperatura de la reacción es demasiado fría o demasiado caliente? • Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada. • Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.

Las muestras de ADN digeridas se guardarán en la nevera para ser analizadas el día siguiente.

Asegúrese de que los pozos están en el lado del polo (-).

Electroforesis en Agarosa: aplicando las muestras • Corriente Eléctrica La corriente mueve el ADN, que tiene una carga negativa, hacia el electrodo positivo (+, rojo). Búfer Tinta Gel de agarosa Fuente de Poder

Electroforesis en Agarosa: corriendo las muestras • La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes. Corriendo la Gel Fuente de Electricidad

Electroforesis en Agarosa: resultados típicos • La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.

Análisis de la Gel Teñida Determine los tamaños de los fragmentos de restricción. • Cree una curva estándar utilizando un marcador de ADN. • Mida la distancia (en mm) recorrida por los fragmentos de restricción. • Determine los tamaños de lo fragmentos de ADN. Identifique la relación entre las muestras.

Determinación del Tamaño Molecular Curva Estándar de “Fingerprinting”: Semilogritmico 100,000 Tamaño (pb) Distancia (mm) 23,000 11.0 9,400 13.0 6,500 15.0 4,400 18.0 2,300 23.0 2,000 24.0 pb = pares de bases mm = milímetros 10,000 Tamaño (pares de baes) B 1,000 100 A 5 10 15 20 25 30 Distancia (mm)

“Fingerprinting” de ADN Extensiones a la práctica de laboratorio • Estudios Independientes • Aislamiento del plásmido de (mini-preps) • La cartografía de un plásmido utilizando las enzimas de restricción • Análisis por “Southern blot” • Prácticas de introducción a la electroforesis: Kool-Aid/FastBlast Indicador de pH en un búfer