Enzimas Somsimith Deechaleune BIOL3051 Laboratorio 5 Enzimas Somsimith Deechaleune BIOL3051

Objetivos Definir qué es una enzima y cómo ésta actúa en las reacciones dentro de la célula. Identificar los diferentes factores que pueden afectar la actividad enzimática. Diferenciar entre inhibición competitiva y no- competitiva.

Introducción Las enzimas son en su mayoría proteínas o RNA (riboenzimas). Son catalizadores químicos que agilizan una reacción química que involucra la formación o rompimiento de enlaces químicos. No se consumen ni se alteran en las reacciones. Al finalizar la reacción la enzima se libera y queda disponible para otra reacción.

Introducción Actúan sobre un sustrato formando un complejo enzima-sustrato al unirse en un lugar específico del sustrato: sitio activo de la enzima. Las enzimas son selectivas, pocas moléculas pueden interactuar con el sitio activo y formar el complejo (figura 1).

Fig. 1: Reacción con participación de una enzima.

Fig. 2: Energía de activación necesaria para iniciar la reacción. Cuando se forma esta interacción baja la energía de activación necesaria para poder llevar a cabo la reacción.

Enzimas en una reacción Funcionan mejor bajo condiciones específicas (óptimas) que incluyen: Temperatura pH Los cambios pueden alterar el desempeño de la enzima, desactivarla o destruirla. Algunas enzimas necesitan activadores para poder formar el complejo enzima-sustrato.

Cofactores e Inhibidores Activadores que cambian la conformación de la enzima para formar el complejo enzima-sustrato reciben el nombre de cofactores: pueden ser iones metálicos (nada orgánico). de origen orgánico se llaman coenzimas.

Cofactores e Inhibidores Los inhibidores impiden la actividad de la enzima, como el pH y la ºT. Pueden afectar el sitio activo de de dos maneras: Competitiva: Bloquea el sitio activo (Fig. 3). No competitiva: Altera indirectamente la forma del sitio activo, al pegarse en otro lugar de la enzima (Fig. 4).

Fig. 3: Inhibición competitiva

Fig. 4: Inhibición no competitiva

Ejemplos de enzimas: Catalasa Se encuentra en casi todas las células aeróbicas. Actúa rompiendo el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno que se produce en las células: Observaremos su funcionamiento en varios organismos. 2 H2O2 catalasa 2 H2O + O2

Ejercicio 1: Funcionamiento de la catalasa en varios organismos. Materiales Peróxido de hidrógeno Papa Hígado Setas Espinaca Gasa (cheesecloth) Placas de porcelana Goteros Morteros o licuadora

Procedimiento En este ejercicio se prepararán varios homogenados para obtener partículas pequeñas y uniformes al mezclarlas con el agua. Para preparar los homogenados, corte en pedazos por separado las muestras de papa, hígado, setas y espinaca. Usando una licuadora o mortero, muela el material con un poco de agua hasta diluir parte de la muestra; no muela excesivamente para que queden pedazos pequeños del material. De ser necesario, filtre el macerado con una gasa (cheesecloth). Coloque cada homogenado en un tubo de ensayo. Usando un gotero, coloque cinco gotas de cada homogenado en las fosas de la placa de porcelana y añada tres gotas de peróxido de hidrógeno.

Reacción al añadir gotas de peróxido. Resultados Resultados homogenado con peróxido de hidrógeno Homogenado Reacción al añadir gotas de peróxido. Agua Papas Setas Hígado Espinaca

Preguntas 1. ¿Qué ocurrió al añadir el peróxido?   2. ¿Ocurrió lo mismo para todas las muestras? 3. ¿Por qué se forman las burbujas? 4. ¿Qué otros organismos podrían usarse para esta prueba?

Ejercicio 2: ¿Se comportan todos los organismos de la misma manera? Materiales Homogenado de hígado, papa, setas y espinaca Tubos de ensayo Peróxido de hidrógeno Goteros

Procedimiento Rotule cinco tubos de ensayo con las letras A a la E. Ponga 3 mL de cada homogenado en los tubos como sigue: A - Hígado B - Papa C - Setas D - Espinaca E - Agua Marque el nivel hasta donde llega cada homogenado. Ponga 3 mL de peróxido de hidrógeno en cada tubo de ensayo. Observe la reacción que sucede en cada tubo y marque el cambio en el nivel del líquido.

Resultados Resultados producción de catalasa en varios organismos Tubo Cantidad de burbujas Cantidad de homogenado consumido A B C D E

Preguntas 1. ¿Qué organismo produjo más gas? 2. ¿Qué gas se está produciendo? 3. ¿Qué sugieren los resultados sobre la fisiología de estos organismos?

Ejercicio 3: Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas. Materiales Homogenado de hígado Baño de agua Agarradera de tubo

Ejercicio 3: Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas. Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas“, la actividad se detiene y cuando se supera un valor considerable la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.

Procedimiento Rotule cinco tubos de ensayo del 1 al 5 y caliente un baño de agua hasta 37 °C y otro hasta 80°C. Añada 5 mL de hígado homogenado a cada tubo. Mantenga los tubos a las siguientes temperaturas: Tubo 1 = 80 °C por 5 minutos Tubo 2 = 37 °C por 5 minutos Tubo 3 = Temperatura ambiental Tubo 4 = Hielo por 30 minutos Tubo 5 = Congelador a 4 °C por 30 minutos Añada 2 mL de peróxido de hidrógeno al tubo 1. Mida el tiempo transcurrido desde que se añadió el peróxido hasta que se comienzan a producir burbujas, y anótelo en la Tabla.. Repita con los demás tubos. Compare sus resultados en término de tiempo de reacción vs. temperatura.

Tiempo que tardó en comenzar reacción Resultados Resultados del efecto de la temperatura Tubo Temperatura Tiempo que tardó en comenzar reacción Observaciones 1 80°C 2 37°C 3 Ambiente 4 Hielo 5 Congelador

Preguntas 1. ¿Cuál es la relación entre la temperatura y la actividad enzimática? 2. ¿Qué le sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas (muy frías o muy calientes)?

Ejercicio 4: El efecto del pH sobre el funcionamiento de las enzimas Todas las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras: El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH. El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH. Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un óptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12

Efecto del pH sobre el funcionamiento de la enzima Procedimiento Rotule tres tubos de ensayo A, B y C Añada 1 mL de homogenado de hígado a cada tubo. Añada 3M HCl y 3M NaOH a los tubos como sigue, y agite suavemente hasta mezclar: Tubo A – tres ml de 3M HCl Tubo B – tres ml de 3M NaOH Tubo C – tres ml de agua (control sin ácido ni base). Añada 3 mL de peróxido de hidrógeno a cada tubo. Observe y anote las reacciones en la siguiente tabla.

Resultados Resultados del efecto del pH sobre la actividad enzimática. Tubo Tiempo que toma la reacción en completarse Descripción comparativa de las reacciones. A B C

Preguntas 1. ¿Cuál es la relación entre el pH y la actividad enzimática? 2. Las enzimas del estómago funcionan mejor con un pH de 2. ¿Cómo afectaría un pH de 4 en el estómago a la digestión?