Fundamentos de PCR Dr. José A. Cardé-Serrano Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Biol 4207 – Lab de Virologia y Biotecnologia Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

Objetivos Estudiar los pasos que componen la reacción de PCR Discutir factores importantes en la optimización de esta técnica Conocer Aplicaciones Preparar una reacción de PCR e incubarla en el termociclador.

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR PCR es básicamente una técnica de amplificación del ADN. Muchas moléculas ADN (molécula sencilla) PCR amplificación Tecnica de amplificacion donde empezamos con cantidades infimas de una porción de DNA y logramos generar millones de copias

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Historia 1985 – se crea la técnica molecular conocida como “PCR” Kary B. Mullis, Coorporacion CETUS Premio Nobel en Química 1993

Procedimiento del “PCR” Desnaturalización Hibridización Extensión

Desnaturalización Calor del ADN 94°C. Filamentos dobles se derriten. Hay una separación física de las dos cadenas.

Hibridización La temperatura se reduce a 54°C. Movimiento Browniano. El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que esta inmersa en un fluido Enlaces de hidrógeno. Filamento de ADN. Bases construidas.

Extensión o Polimerización Temperatura de polimerasas 72°C. Los “primers” tienen una fuerte atracción al molde o templado Los “primers” sin exacto pareo se pierden. No dan extensiones de fragmento. El procedimiento se repite y se forman copias del ADN.

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Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta temperatura (~100°C)

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC Primer Ciclo 2do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

PCR LINK

Hay 6 componentes esenciales en el proceso de PCR ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

ADN polimerasas termoestables Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado. Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta Algunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades) La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

Oligonucleótidos iniciadores (primers) Se conoce su secuencia Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb) Requieren de un cuidadoso diseño Reglas de diseño: (a) longitud = 18-25 bases (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas

Evitar las secuencias repetidas 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’ 3´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ Hay un 3’OH disponible para la Taq!! Extiende 5´ 3´ 3´ 5´ Dímero de primer

Evitar las secuencias repetidas 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´ 5´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ Secuestra primers pero no enzima…no hay extension 5´ 3´ 3´ 5´ no hay extensión

Evitar las secuencias repetidas 5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT Formación de horquillas PCR 5´ 3´ 5´ Secuestra mitad de los primers y parte de la enzima… hay extension 3´ 5´ 3´ Productos de PCR no deseados

ADN molde (templado) Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble cadena) ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de plasmídico Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55% Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers demasiado alta = poco o nada de producto demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos Extensión - a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada ej.: 72°C para Taq

Variantes de la PCR Touchdown PCR Colony PCR Multiplex PCR Hot start PCR Nested PCR Inverse PCR Long PCR Quantitative “real time” PCR

Multiplex PCR Describe una PCR en la cual hay presentes múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico Ahorra templado, tiempo y gastos Requiere una cuidadosa optimización

Nested PCR A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo, apareciendo un “esparcido” Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (esparcido) Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers

Nested PCR 1era PCR Esparcido de ADN 2da PCR ADN específico

Clonado con PCR: clonado T-A Producto de PCR a partir de Taq Vector con cola-T ligamiento A La Taq pol tiene actividad de Terminal transferasa, anadiendo una A en el terminal 3’ temporera Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor que ligamiento con extremos romos

Mutagénesis por PCR Introduce cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN El método de extensión solapada requiere 2 primers mutagénicos y otros 2 Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación Usa los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa

Mutagenesis con PCR- extension solapada Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward) primer mutagénico inverso (reverse) Primer T7 X x remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar 2da PCR Dos 1ras PCRs separadas

RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa Para amplificar copias de cADN de ANR Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de ANR Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cANDs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer “antisense” y un AND polimerasa dependendinte de ANR Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el duplex de cAND por PCR

RT-PCR LINK mANR (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ mANR (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o Transcripción reversa GSP1 (sense) GSP (antisense) AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ 1ra cadena cDNA PCR usando GSP+GSP1 GSP1 GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

Real Time - PCR Alta especificidad Usa primers marcados con moleculas fluorescentes Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos Sensitividad mucho mayor LINK

Amplificación de DNA de Fago λ Parte Práctica Amplificación de DNA de Fago λ

Lambda ADN Bacteriófago Lambda (λ) Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7 strain) Usado como sustrato para enzimas de restricción Peso molecular 31.5×106 daltons y genoma de 48502 pares de bases

Secuencia de Lambda DNA Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162: 729-773

Protocolo Seguir el protocolo delineado en el “PCR AMplificatiom Kit” Cat. #R011 React Vol (ul) [ ] Fin [ ] Ini PCR Buff 5 1x dNTP Mix 4 200uM Primer 1 0.5 0.2uM Primer 2/3 Taq Pol 0.25 1.25U/50ul - DNA Temp 0.5ng/50ul dH20 50 (39.25) Total 50

Sondas control Sonda control 1 Sonda control 2 Sonda control 3 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’ Sonda control 2 5’-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3’ Sonda control 3 5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’

¿Preguntas?

Preguntas Muy poco magnesio no produce suficiente producto de PCR y mucho produce bases pareadas erróneas, ¿por qué? Al escoger los “primers” es importante evitar secuencias que sean complementarias entre estos, ¿por qué? ¿Como cambiaria el producto del PCR si en vez de amplificar ADN viral se amplificara ADN bacteriano (este ADN es metilado)?

Asignación Hacer un reporte con la secuencia de λ y donde en ella se pegan los primers usados. Demostrar la complementaridad y la secuencia comprendida en la amplificación.