Técnicas de manipulación del genoma.

Pero,¿qué necesitaremos recordar?

Estructura de un gen PROMOTOR RNA(cDNA) Intrones Exones PROTEÍNA

Al azar Introducción de DNA exógeno en el genoma

GENOMA GEN TRANSGÉN

GEN Al azar TRANSGÉN Concatémeros Gen crucial Zonas metiladas

Muertecelular

Recombinaciónhomóloga Al azar Introducción de DNA exógeno en el genoma

GEN TRANSGÉN Recombinación homóloga Recombinación homóloga TRANSGÉN

Para poder realizar la recombinación homóloga son necesarias células en cultivo

¿QUÉ es la Terapia génica? “Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico.” DNA como medicamento o Curar con genes

¿QUÉ es Gene Marking? “Proceso que utiliza técnicas comunes a la Terapia Génica pero sin buscar un efecto terapéutico.” Ej. Seguir la pista a determinadas células en el organismo.

“Suprimir función” “Añadir función” Terapia Génica

“Añadir función” Terapia Génica

Sustitución del gen deseado.Sustitución del gen deseado. Reparación de una mutación.Reparación de una mutación. Añadir un genAñadir un gen Añadir función

Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual)Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual) Introducción del transgen al azarIntroducción del transgen al azar (añadir un gen) (añadir un gen) Añadir función

“Suprimir función” Terapia Génica

Muerte celular (suicidio de las células)Muerte celular (suicidio de las células) Oligonucleótidos antisentido (expresión).Oligonucleótidos antisentido (expresión). Ribozimas (Ruptura).Ribozimas (Ruptura). Suprimir función

OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO iRNA: RNA de interferencia

MODOS DE INTRODUCCIÓN

“Ex vivo” “In vivo” Terapia Génica

EX VIVO INDIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos DIRECTOS QUIMICOS FISICOS Precipitación con fosfato de calcio Precipitación con fosfato de calcio Electroporación DNA desnudo IN VIVO/EX VIVO

David "niño burbuja", (Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)

Tratamientos - Aportación de la enzima recombinante: ADA PEG-ADA - Transplante de médula osea.

1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa Combinada Dr Blaese (EEUU) Dr. Bordignon (Italia) Demuestran la eficacia del tratamiento

Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad. (Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada -Mutación en el Cromosoma X - Deficiencia en la cadena  del receptor para la interleukina IL2RG - Hospital Necker de Paris (11 niños)

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada -3 de los niños sufrieron una leucemia. - ¿Por qué? -Efecto posición (LMO2) Efecto sobreexpresión- 2006

Para saber que se está haciendo… Sociedad Europea de TG Sociedad Americana de TG

1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal - Incremento de productividad Cuantitativo Cualitativo - “Biotecnología de corral” 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

TRACY  s1-antitripsina humana  s1-antitripsina humana Promotor  -lactoglobulina ovina Promotor  -lactoglobulina ovina

Primeros ensayos en ratón: 4.3 Kb Promotor WAP de ratón 6.6 Kb de AAT-humano cDNA 12.5 gr./litro Obtienen microlitros de leche Volumen/año gr./año Producción vital 8 litros 400 litros l Kg. 2 kg. 50 kg 1 Kg. 100 kg. toneladas Coneja Oveja Vaca

Roslin Institute-PPL Therapeutics (lo que sabemos......)  s1-antitripsina Fibrinógeno Factor VII y Proteína C Factor XI BSSL (lipasa) Anticuerpos humanizados

Organismos modelos

Ratón Especie de elección Metodología de creación puesta a punto. Corto intervalo generacional Numerosos descendientes. Especie de elección Metodología de creación puesta a punto. Corto intervalo generacional Numerosos descendientes.

¿Pero, hay muchos modelos animales?

Mouse Models for Human Disease