Métodos de esterilización y desinfección. Medios de cultivo. Curso: Diagnóstico de enfermedades vegetales 27 de mayo de 2011 Ing. Agr. MSc. Vivienne Gepp

Objetivo Que el estudiante se familiarice con los procesos de desinfección y esterilización comúnmente utilizados en un Laboratorio de Fitopatología. Conocer los medios de cultivo más usados.

Definiciones Esterilización = proceso mediante el cual se matan o eliminan todas las formas de vida microbiana.  estéril o no estéril. Desinfección = eliminar microorganismos patógenos total o parcialmente  niveles de desinfección. Asepsia = exclusión continuada de microorganismos contaminantes.

Métodos de esterilización FISICOS: Calor seco (llama, horno) húmedo (autoclave) Radiaciones MECÁNICOS Filtración QUIMICOS Gaseosos No gaseosos

Calor seco Esterilización directa en la llama

Calor seco alcohol 96% + mechero

Calor seco alcohol 96% + mechero

Calor seco Horno

Calor seco - Horno Se utiliza para: Temperaturas: vidrio seco T ºC horas Se utiliza para: vidrio seco instrumentos quirúrgicos objetos metálicos aceites, vaselinas y polvos Temperaturas: 180 ºC ---------- 30 - 60 min. 170 ºC ---------- 60 - 120 min

Calor seco Recipientes de metal o envolver en papel (usar temp. menor en este caso) Dejar que vuelva a temp. ambiente antes de abrir

Calor húmedo Con presión: autoclave, olla presión Para sustancias estables al calor ¿combinaciones reactivos a temp altas? Temperatura – presión – tiempo Temp. 100 110 115 121 125 130 Tiempo 20 h 2,5 h 51 min. 15 min. 6,4 min. 2,4 min.

Autoclave

Temperatura interna (ºC) según % aire eliminado Autoclave Presión (lb/in.) Temperatura interna (ºC) según % aire eliminado 100% 66% 50% 33% 0% 5 109 100 94 90 72 10 115 105 15 121 112 25 130 126 124 30 135 128

Calor húmedo - Autoclave ¿cómo optimizar eficacia? eliminar aire, contenidos similares, no apretados, dejar espacios verticales, Precauciones: tapas sueltas, recipientes con hasta 1/3 de volumen, vuelta a presión normal lenta.

Controles de esterilización Físicos Químicos Biológicos

Controles de esterilización Físicos Químicos Biológicos

Esterilización química Ventajas: no requiere altas temperaturas ni aparatos costosos Desventajas: mayor tiempo, sustancias inflamables y muy tóxicos y alto costo Ejemplos: óxido de etileno, formaldehído

Esterilización por filtrado Elimina microorganismos >virus Ventaja: no modifica composición Para: cantidades pequeñas Para: vitaminas, hormonas, antibióticos, etc. Requiere bomba de vacío Ejemplo membranas de ésteres de celulosa: 1 uso, “poros” de 0,22 µm

CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR

Radiaciones UV

Desinfección superficial

Desinfección superficial Técnicas comunes en Fitopatología: Lavado previo en agua corriente detergente? cepillo? Agua corriente 2 o más horas Alcohol 70% Hipoclorito de sodio: 1% Cloro activo, 2 %, 0,35% etc. minutos enjuague posterior

Desinfección superficial Selección de técnica(s) según: tejido: grosor, consistencia hongo a aislar: ej. Oomycetes, Rhizoctonia dónde pensamos que está el patógeno

Medios de cultivo Componentes básicos ¿Sólido o líquido? Ajuste de pH Inhibidores de “contaminantes”: bacterias hongos no deseados

Clasificación de medios de cultivo Sintéticos – más complicados para elaborar, muchos componentes Naturales – raíces y frutos aportan lo necesario para hongos, ¿bacterias necesitan más? Semi-sintéticos

¿Qué aportan los medios? Soporte - Agentes solidificantes: gelatina: fusión a 37ºC, solidifica 25-30ºC, se descompone a 121ºC agar: fusión a 80-100ºC, solidifica a 35-50ºC Carbono orgánico Azúcares inducen crecimiento micelio, pueden inhibir esporulación temporal- o permanentemente. Vitaminas y otros factores de crecimiento Inhibidores Sustancias que permiten diferenciar spp. o biotipos Indicadores

Medios comunes: Agar papa dextrosa Agar agua Agar malta Agar harina de maíz Agar V8 Nutriente agar dextrosa Extracto de levadura dextrosa con carbonato de calcio (Yeast Dextrose CaC03) B de King

Dispensado de medios Temperatura: 45-50ºC mayor: condensa H2O menor: solidificación prematura Placas de Petri: aprox. 20 ml c/u Tubos de ensayo: vertical o pico de flauta