Métodos aplicados para -caroteno Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química Química de Alimentos y Materias Grasas Métodos aplicados para -caroteno Taller FAO, 2008 Dra. Paz Robert C.

Estructura básica Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5 C unidas de manera tal que el orden se invierte en el centro. Amplio sistema de doble enlace conjugado.

Carotenos principales Análisis de Carotenoides Dependiendo del grado de información deseado -caroteno Provitamina A Composición completa Provitamina A Carotenos principales

Características espectrales Espectro de absorción de carotenoides son dependientes del solvente 1%A1cm usado en el cálculo de la concentración también varía marcadamente con el solvente Caroteno Solvente max 1%A1 cm -caroteno Acetona (429) 452 478 - cloroformo (435) 461 485 2396 etanol (425) 450 2620 hexano 477 2592 Carotenoides en solución obedecen la Ley de Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente proporcional a la concentración. Britton, 1995; Rodriguez-Amaya. 2001

POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS Moléculas altamente insaturadas TRANS CAROTENO isomerización oxidación EPOXICAROTENOS APOCAROTENOS CIS-CAROTENOS oxidación Pérdida de color Pérdida valor nutritivo Pérdida de sabor COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR

... Isomerización cis causa leve pérdida de color, disminución de 2 a 6 nm en la , aparición de un pick en la región UV Licopeno trans 15-cis 13-cis

Procedimiento Analítico Muestreo y preparación de la muestra Extracción con acetona en frio Transferencia (partición) a éter de petróleo, hexano, eter etílico Saponificación y lavado Concentración en evaporador rotatorio (<35°C) Separación cromatográfica Identificación y cuantificación.

Muestreo y preparación de la muestra. Homogenización de la materia prima Extracción con acetona en frío

Partición a éter de petróleo

Separación OCC FM: porcentajes crecientes de acetona en éter de petróleo MgO : Celite (1:1) Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de elución cromatográfica reacciones específicas.

Fases Estacionarias-OCC Alúmina Sílica CaCO3 Ca(OH)2 MgO ZnCO3 Tierras silíceas (tierra de diatomeas, kieselguhr, hyflosupercel) Celulosa, almidón, dextran cross-linked (sephadex), Polietilen Mezclas de ellos Rodriguea-Amaya, 2001

Criterios de identificación OCC Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Orden de salida OCC y Rf(TLC). Estructura fina del espectro (%III / II)*100 Britton, 1995

Espectro de absorción max zeinoxantina 421 445 474 -criptoxantina 421 445 475 Luteina 421 445 475

Espectro de absorción max -criptoxantina (425) 449 476 zeaxantina (424) 449 476

Métodos Oficiales AOAC Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15) /método espectrofotométrico. Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método espectrofotométrico Carotenos y carotenoides en productos de macaroni Ch-32 (938.04) Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)

Carotenos en plantas frescas Pigmentos solubles en grasa, extraídos y cromatografiados para remover clorofilas e hidroxicarotenos, los cuales son determinados espectrofotométricamente y expresados como beta-caroteno MUESTRA Extracción Acetona /hexano (40+60) COLUMNA Elución acetona:hexano (1+9) ESPECTROFOTOMETRÏA 436 nm MgO:hyflosupersel (1:1)

Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Muestra agua Hexano-acetona-etanol absoluto-tolueno (10+7+6+7) Saponificación en caliente Saponificación en frío Silica gel G+hyflosupersel (1:1) Carotenos Hexano:acetona (96+4),  436 nm MHC Hexano:acetona (90+10)  474 nm Zeinoxantina, criptoxantina DHC Hexano:acetona (80+20)  474 nm Luteina, zeaxantina xantofilas Hexano;acetona:metanol (80:10:10) Violaxantina, neoxantina, otros MgO:hyflosupersel (1:1) Carotenos Hexano:acetona (90+10) Total xantofilas Hexano;acetona:metanol (80:10:10)

Separación-HPLC Fase inversa-Fases enlazadas Fase Inversa-HPLC RP-18 ó C18 RP-8 ó C8 C-30 Ntrilo, amino Fase Inversa-HPLC Columnas enlazadas RP-18: Aplicable a carotenoides de todos los niveles de polaridad. Materiales RP son inertes, formación de artefactos es mínima. Se puede trabajar en elusión con gradiente

Separación-HPLC Fase Normal Ca(OH)2 Alúmina Sílice Fase Normal Sílice compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad, útil para separación de xantofilas, los carotenos son pobremente resueltos Alúmina, Ca(OH)2 Para algunas separaciones especiales. Presentan dificultades prácticas: tienen una vida corta y necesitan un control riguroso de humedad

Criterios de identificación-HPLC Tiempos de retención tr Tiempo de retención relativo TRR = tr,i / tr,st Adición a la muestra del componente supuesto: normalmente se agrega a la muestra, el supuesto componente i y se ve cual pico crece. Correlaciones gráficas de estructura -retención Siempre que sea posible, la sustancia patrón debe formar parte de la mezcla que se está analizando. Si no está presente en la muestra original, debe mezclarse previamente al análisis cromatográfico. La sustancia patrón debe elegirse de modo que su correspondiente pico aparezca en el centro de la serie de compuestos cuyas retenciones relativas deben determinarse. Debe emplearse la menor cantidad de muestra posible, ya que la cantidad de muestra puede influir en el tiempo de retención. 2.-Desventaja: Datos de retención son característicos pero no específicos. El pico de la muestra y del patrón tienen el mismo tiempo de retención o muy próximos, pero no proporciona una prueba absoluta. Es necesario la repetición del método en otra columna de distinta polaridad correlaciones gráficas de estructura -retención Aplicable a series homólogas de estructura. Log( tr) frente a log (n°átomos de carbono)

Criterios de identificación HPLC Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Espectro de masas que confirme por lo menos la masa molecular. Siempre que sea posible, la sustancia patrón debe formar parte de la mezcla que se está analizando. Si no está presente en la muestra original, debe mezclarse previamente al análisis cromatográfico. La sustancia patrón debe elegirse de modo que su correspondiente pico aparezca en el centro de la serie de compuestos cuyas retenciones relativas deben determinarse. Debe emplearse la menor cantidad de muestra posible, ya que la cantidad de muestra puede influir en el tiempo de retención. 2.-Desventaja: Datos de retención son característicos pero no específicos. El pico de la muestra y del patrón tienen el mismo tiempo de retención o muy próximos, pero no proporciona una prueba absoluta. Es necesario la repetición del método en otra columna de distinta polaridad correlaciones gráficas de estructura -retención Aplicable a series homólogas de estructura. Log( tr) frente a log (n°átomos de carbono)

Cuantificación Curva de calibración  Comparación con muestras de concentración conocida Cs/Cst = As/Ast Standard Interno Fi (Ci/Cst) = (Ast/Ai)

Características espectrales de carotenoides Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa) Características espectrales de carotenoides identificados Fracción Fase movil Máx long de onda Identificación Rf** Máx long de onda Literatura* 1 5% acetona (426) 448 476 B-Caroteno 0,98 (425) 450 477 2 10% acetona (422) 444 472 Zeinoxantina 0,43 421 445 475 3 20%acetona 450 Apocarotenal prob. 0,98 4 30-40% acetona (424) 442 468 Anteroxantina prob 0,19 (422) 445 472 5 60% acetona (422) 442 472 Luteína 0,19 (421) 445 474 zeaxantina (424) 449 476 6 100% acetona 432 458 488 Rubixantina 0,52 434 460 490 7 10% agua-acetona 442 468 500 Licopeno 0,98 444 470 502 * Davies, 1976; Rodriguez-Amaya, 1999 ** Placa de sílice, FM metanol 5% en benceno

HPLC (Rosa Mosqueta) Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mm Rubixantina Licopeno -caroteno Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mm Fase móvil: acetonitrilo: metanol: acetato de etilo (65: 20: 15) Flujo: 1ml/min

Zanahoria Tomate Identificación por Trr con patrones extraídos.