Tema 25. Conjugación pilus pelo F o pelo sexual receptora o hembra pelos o fimbrias pilus pelo F o pelo sexual receptora o hembra donadora o macho proceso unidireccional (Hayes, 1953)

25. Conjugación • Conjugación: descubrimiento y el proceso • Factor F o factor de fertilidad: tipos sexuales • Tipos de conjugación: F+ X F-, Hfr X F-, F’ X F- • Mapa genético por conjugación interrumpida - mapa circular - distintas estirpes Hfr • Mapa de ligamiento

Lederberg y Tatum, 1946 (P. Nobel 1958) conjugación http://nobelprize.org/medicine/laureates/1958/index.html ¿Hay recombinación (sexo) en bacterias? Figure: 09-03. Genetic Recombination of Two Auxotrophs Genetic recombination of two auxotrophic strains producing prototrophs. Neither auxotroph grows on minimal medium, but prototrophs do, suggesting that genetic recombination has occurred. 108 células Lederberg y Tatum, 1946 (P. Nobel 1958)

tubo en U tubo en U pasa el medio pasan moléculas no pasan células La conjugación requiere contacto entre las bacterias Figure: 09-04. Davis Experiment When strain A and B auxotrophs are grown in a common medium but separated by a filter, as in this Davis U-tube apparatus, no genetic recombination occurs and no prototrophs are produced. no nutrición cruzada no transformación (1944)

Conjugación: transferencia unidireccional orientada

pareja específica pareja efectiva a) pareja específica; b) pareja efectiva

Factor F (Hayes): - independiente de marcadores cromosómicos (se pierde y se transfiere en mayor proporción) no un gen con dos alelos (aumentan F+ en función del tiempo) F es un plásmido: círculo de DNA de doble cadena con replicación independiente del cromosoma

Factor F factor F o factor de fertilidad inserción en el cromosoma replicación transferencia Factor F Unos 100 genes Transferencia (unos 22 genes): formación de los pili, origen de transferencia, corte del DNA, regulación del proceso

Tabla: tipos conjugantes Tipos sexuales: F+, F-, Hfr, F’ y sfa (afines al factor sexual) Conjugación: transferencia unidireccional orientada sfa parte de F en cromosoma (afines al factor sexual)

F+ X F- 5’ puente de conjugación donadora receptora Conjugación: transferencia unidireccional orientada Pareja específica; 2. Pareja efectiva; 3. Movilización de F o del cromo Hfr (5’) 4. DNA lineal: tira y empuja; 5. Emparejamiento region homóloga (Hfr); 6. Nº par de sobrecruzamiento (Hfr) Figure: 09-06a and b. F+ X F- Mating An F+ X F- mating demonstrating how the recipient F- cell converts to F+. During conjugation, the DNA of the F factor replicates with one new copy entering the recipient cell, converting it to F+. The black bars added to the F factor follow their clockwise rotation during replication.

F+ pasa a Hfr 1/1000 células F+ pasan a ser Hfr Figure: 09-10a. Conversion of F+ to an Hfr State Conversion of F+ to an Hfr state occurs by integrating the F factor into the bacterial chromosome. The point of integration determines the origin (O) of transfer. During conjugation, an enzyme nicks the F factor, now integrated into the host chromosome, initiating transfer of the chromosome at that point. Conjugation is usually interrupted prior to complete transfer. Above, only the A and B genes are transferred to the F- cell, which may recombine with the host chromosome. Hfr: alta frecuencia de recombinación (Cavalli-Sforza, 1950) F+ to Hfr

inserción de F: F+ pasa a Hfr ¡un único sobrecruzamiento! Todo esto propuesto sin saber que los cromosomas son circulares! (se conoce en 1962)

recombinación homóloga Hfr X F- Hfr X F- dos sobrecruzamientos Conjugación: transferencia unidireccional orientada Pareja específica; 2. Pareja efectiva; 3. Movilización de F o del cromo Hfr (5’) 4. DNA lineal: tira y empuja; 5. Emparejamiento region homóloga (Hfr); 6. Nº par de sobrecruzamiento (Hfr) recombinación homóloga no recíproca

frecuencia de transferencia de material genético en conjugación F+ X F+ o F+ X Hfr: no hay contacto F+ X F- => genera un F+ (1/5) y baja recombinación (1/107) Hfr (1/103) X F- => receptora F- y alta tasa de recombinación (1/104)

Hfr genera un F’ Hfr genera un F’ F’: factor F modificado

excisión: Hfr genera un F’ puede generarse también una estirpe sfa

F’ X F- Figure: 09-11b Title: Conversion of an Hfr Bacterium to F’ Caption: Conversion of an Hfr bacterium to F’ and its subsequent mating with an F- cell. The conversion occurs when the F factor loses its integrated status. During excision from the chromosome, it carries with it one or more chromosomal genes (A and E). Following conjugation with an F- cell, the recipient cell becomes partially diploid and is called a merozygote; it also behaves as an F+ donor cell.

merodiploide o merocigoto o diploide parcial Sexducción o F-ducción: transformación en genes cromosómicos, siempre los mismos Revierten con alta frecuencia a Hfr, generando siempre el mismo Hfr Proceso: sexducción o F-ducción Regulación génica: dominancia/recesividad en células n, cis/trans Cartografiado: dos genes en un F’, es porque están juntos en cromosoma

Mapa por conjugación interrumpida Mapa genético por gradiente de transferencia (conjugación o apareamiento interrumpido, Jacob y Wollman 1955) Mapa por conjugación interrumpida

a mayor tiempo entran marcadores (genes) nuevos

transferencia secuencial y lineal de genes de Hfr a F- Cromosoma se establece como una estructura lineal y circular! La conjugación es un proceso de transferencia de material genético unidireccional y orientada

Mapa por conjugación interrumpida gradiente de transferencia Mapa por conjugación interrumpida porcentaje máximo Mapa genético por ordenación de genes mediante gradiente de transferencia, que se genera por interrupción forzada o natural del proceso de conjugacion: el porcentaje máximo de recombinantes es menor para los genes que entran posteriormente

Figure: 09-07. The Progressive Transfer of Genes During Conjugation The progressive transfer during conjugation of various genes from a specific Hfr strain of E. coli to an F- strain. Certain genes (azi and ton) transfer more quickly than others and recombine more frequently. Others (lac and gal) take longer to transfer and recombine with a lower frequency.

mapa circular (Jacob y Wollman, 1957) Ledeberg: mapa con tres ramas?; Jacob y Wollman: cromosoma lineal Mapa circular -> el cromosoma es circular: orden relativo de genes siempre el mismo Definitivo: Cairns por autorradiografia, 1962 Figure: 09-09. The Order of Gene Transfer in E. coli (a) The order of gene transfer in four Hfr strains, suggesting that the E. coli chromosome is circular. (b) The point where transfer originates (O) is identified in each strain. Note that transfer proceeds in either direction, depending on the strain. The origin is determined by the point of integration into the chromosome of the F factor, and the direction of transfer is determined by the orientation of the F factor as it integrates. orden relativo de genes siempre igual

distintas estirpes Hfr Varían en el lugar y la orientación de la integración de F (distinto origen y direccion de transferecia) difieren en el lugar y orientación de la inserción de F (distinto origen y dirección de transferencia)

mapa genético de E. coli por conjugación interrumpida, 1963 hoy 100 min

Mapa de ligamiento: análisis de la frecuencia de recombinación selección de Leu+ (marcador tardío) y entre estos determinar los diferentes tipos de recombinantes ejemplo: problema 8.9 Recombinación de puntos cercanos (< 2 min)

5% -> 5 um leu-arg 5% -> 5 um arg-met ≈90% ≈0,25%

a----------------b-c ó a ----------------c-b ??? orden de los genes a----------------b-c ó a ----------------c-b ??? Partimos de dos estirpes: a+b+c- y a-b-c+ Cruzamientos recíprocos, con ambas opciones (a-bc y a-cb) Determinar recombinantes a+b+c+ Orden en función del número de recombinantes obtenidos en los dos cruzamientos recíprocos determinación del orden de genes cercanos: a partir de frecuencias relativas de recombinantes en cruzamientos recíprocos ejemplo: problema 8.7

Tabla: resultados conjugación

problemas capítulo 8 problemas: 7-13 aprox. 1h de clase