Prote í na purificada Cristales Difracci ó n de rayos X Obtenci ó n de fases Mapa de densidad electr ó nica Construcci ó n de modelo Refinamiento Validaci ó n

Por qu é necesitamos cristales para ver difracci ó n? Amplificaci ó n de la se ñ al ….(efecto de interferencia a tener en cuenta!) mol é cula celda unidad cristal

Difracci ó n: Cada electr ó n dispersa Las ondas emitidas se suman … y se restan!! El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada direcci ó n Usar el sitio interactivo ProjectJava/Bragg/home.html Ley de Bragg : n  = 2d sin 

Difracci ó n: ondas en fase 1.Cu á ndo dispersan en fase dos ó m á s ondas? Cuando recorren la misma trayectoria … como en el fen ó meno de la reflexi ó n de luz

Difracci ó n: ondas en fase 2Cu á ndo dispersan en fase dos ó m á s ondas? Cuando sus trayectorias difieren por un m ú ltiplo de la longitud de onda … como en el fen ó meno de la difracci ó n de luz = 2d sin 

Difracci ó n: ondas en fase Cuanto mayor es el á ngulo de difracci ó n, m á s peque ñ o es el espaciamiento para el que la difracci ó n es sensible = 2d sin  sin  /  = 1 / d Cambiando la direcci ó n del haz entrante Mirando diferentes planos en el cristal

Qu é clase de informaci ó n obtenemos de esto? ~posici ó n relativa de los centros dispersores (scatterers), esto es, los á tomos, en la direcci ó n perpendicular a los planos considerados En la direcci ó n del á ngulo negro va a registrarse baja intensidad difractada seg ú n el rojo, mayor Por qu é ? Difracci ó n: ondas en fase

Cu á ndo vemos difracci ó n de un cristal? Un cristal amplifica la difracci ó n en ciertas direcciones, aqu é llas para las que la totalidad de las celdas unidad dispersan en fase… y las elimina en las otras direcciones Antes que nada: s ó lo planos repetitivos pueden dispersar en fase debido a la simetr í a del cristal (repetici ó n de la celda), esos planos tienen relaciones enteras con los ejes de la celda!!

a b c : los tres ejes de la celda unidad Los planos de Bragg conectan divisiones enteras de cada eje plano plano Cu á ndo vemos difracci ó n de un cristal?

Ahora mirando diferentes orientaciones en 2 dimensiones plano plano plano Indices de Miller h k l Cu á ndo vemos difracci ó n de un cristal?

Resoluci ó n Grado de detalle

detalle distancia entre planos ordenados del cristal

Si los á tomos estuvieran quietos y el orden cristalino fuera perfecto, la resoluci ó n estar í a limitada s ó lo por la E   í a  este no es el caso : desorden, alto contenido de solvente (~50%), flexibilidad…. 4 Å mala 3 Å m á s o menos Å razonable 1.5 Å muy buena <1 Å excepcional El l í mite de resoluci ó n en prote í nas

La difracci ó n ocurre en el espacio rec í proco Si cualquier punto en el cristal puede ser definido como un vector tridimensional r = xa + yb + zc entonces, la difracci ó n ocurre en un espacio rec í proco de manera que s = ha* + kb* + lc* Cada eje de esta celda rec í proca queda definido teniendo una direcci ó n perpendicular a los otros dos ejes del espacio real y una longitud igual a la rec í proca del espaciamiento entre los planos definidos por dichos ejes

Espacio rec í proco Construcci ó n de la esfera de Ewald

Espacio rec í proco de un verdadero cristal de prote í na…

Teor í a de Fourier El patr ó n de difracci ó n est á relacionado al objeto que difract ó las ondas, a trav é s de una operaci ó n matem á tica denominada transformada de Fourier

Teor í a de Fourier El patr ó n de difracci ó n est á relacionado al objeto que difract ó las ondas, a trav é s de una operaci ó n matem á tica denominada transformada de Fourier

Teor í a de Fourier El patr ó n de difracci ó n est á relacionado al objeto que difract ó las ondas, a trav é s de una operaci ó n matem á tica denominada transformada de Fourier Importante! Esta integral puede invertirse…. Atenci ó n a F, es un vector!

El problema de las fases Dado que F hkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!) F hkl 2 es directamente proporcional a la intensidad medida I hkl …pero la informaci ó n sobre  se perdi ó !

Soluciones al problema de las fases : Hip ó tesis (re)emplazo molecular estructura ≈ conocida Perturbar la estructura (y con ella la difracci ó n) Reemplazo Difracci ó n isomorfo an ó mala

Fitting y refinamiento Con la densidad electr ó nica proyectada en una estaci ó n gr á fica, uno tiene que construir un modelo at ó mico que encaje bien en la densidad tenga sentido qu í mico y f í sico Este modelo predice un patr ó n de difracci ó n (a trav é s de una transformada de Fourier inversa), y uno usa luego programas para minimizar la diferencia entre las amplitudes F hkl calculadas y observadas

Construyendo el primer modelo Los mapas de densidad electr ó nica son el resultado final del experimento de difracci ó n. Su interpretaci ó n en t é rminos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalogr á fo

Con lo que el problema de fitear un modelo se asemeja al de 'no perder de vista los á rboles en el bosque' esqueletonizaci ó n Construyendo el primer modelo

1.Con estos mapas esqueletonizados, lo primero es trazar la cadena principal (ayuda: los C  est á n a ~3.8 Å unos de otros!) 2.Luego, se ajustan las cadenas laterales Construyendo el primer modelo

Validaci ó n de modelos Chequear la geometr í a del modelo construido: par á metros estereoqu í micos, distancias y á ngulos de enlace, á ngulos dihedros permitidos, etc, etc, etc. Gr á fico de Ramachandran de á ngulos dihedros  y 

Lisozima «made in Uruguay» : 1.4Å resolución R work =15.1% R free =18.2% Fases experimentales!! (solvent flattened SAD) Dispersión anómala de los S and Cl -, a la  Cu K  (1.542Å)

Estructura de un represor transcripcional (FapR) : MAD (1 Se/21kDa) + DM 50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl 2,15% PEG4000 P , a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å Protein cleaved during purification/storage!!

Estructura 3D de FapR Soaking de Mal-CoA 0 min 1 min 5 min 50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl 2,15% PEG4000 P , a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å

Complejo FapR  - malonil-CoA Schujman et al., EMBO J, 2006

Buenos sitios www para ver : Buenos libros para leer : T.L. Blundell & L.N. Johnson (1976), "Protein Crystallography", Academic Press: London. Jan Drenth (2007), "Principles of Protein X-ray Crystallography", 3rd edition. Springer-Verlag: New York. D. Sherwood (1976), "Crystals, X-rays and Proteins", Longman: London.

Muchas gracias!

Conceptos b á sicos de difracci ó n: ondas, interferencia y espacio rec í proco Qu é son los Rx? E Fotones = propagados como una onda amplitud longitud de onda E(t) = A cos(  t +  )  t  =2    (fase)

Qu é son los Rx? E Fotones = propagados como una onda amplitud longitud de onda E(x) = A cos(  x +  )  x  =2  (fase) Ondas

Ondas Si combinamos la variaci ó n en el espacio y en el tiempo A cos[2  ( t-x/ )] efectos “opuestos” del tiempo y la distancia

Adici ó n de ondas + = Sumando el valor del campo el é ctrico para cada punto t … …da el campo total en t “interferencia constructiva”: la amplitud aumenta. La suma de dos ondas con longitud de onda siempre produce una onda resultante de long de onda.

Interferencia destructiva + = Diferencia de fase = 180° La amplitud disminuye

Sumando ondas como vectores Si queremos sumar todas las ondas dispersadas por el elctron e - de una prote í na, usando expresiones de la funci ó n de onda obtenemos operaciones trigonom é tricas MUY feas … A cos(  +  1) + B cos(  +  2) + … Dado que tenemos dos tipos de informaci ó n (variables) en cada onda, mplitud y fase, podemos usar la notaci ó n de vectores para facilitar las operaciones Imaginar una rotaci ó n const. del vector 1; y graficar el cos o el sin de     iempo

Ahora la adici ó n y sustracci ó n se vuelven una operaci ó n geom é trica simple Sumando ondas como vectores

Algunas disgresiones matem á ticas … Este formalismo usando n ú meros complejos en lugar de vectores "simples", es de enorme utilidad! Las ondas pueden siempre separarse en sus componentes de ondas simples coseno y seno E(t) = A cos(  t +  ) A cos(  t +  ) = A cos  cos  t - A sin  sin  t amplitud del componente coseno amplitud del componente seno Usando la regla de la suma de á ngulos:

E(t) = A cos(  t +  ) A cos(  t +  ) = A cos  cos  t - A sin  sin  t amplitud del componente coseno amplitud del componente seno Ahora las ondas pueden ser sumadas sumando los dos componentes: real e imaginario. r i A  Usando la regla de la suma de á ngulos: Algunas disgresiones matem á ticas …

Los n ú meros complejos son del tipo z = a + ib donde i = √-1 La rotaci ó n en el plano complejo es posible por multiplicaci ó n de vectores √i = 45° Diagram de Argand (plano complejo) Algunas disgresiones matem á ticas …

Con lo que, A cos(  t +  ) = A cos  cos  t - A sin  sin  t, para  t constante puede escribirse A cos  + i A sin  ó aun, A e i        = fase z1z2 = |z1| exp(i  1) |z2| exp(i  2) = |z1||z2| exp[i(  1 +  2)]

Teorema de Euler La suma del coseno de  m á s i veces el seno de  es el n ú mero e elevado a i veces . Algunas disgresiones matem á ticas …