Enzimas de Restricción Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé, phd UPR – Aguadilla

Objetivos Al completar esta presentación los estudiantes podrán: Definir lo que son las enzimas de restricción Describir los criterios para su nomenclatura Explicar los factores que afectan la actividad de estas. Mencionar algunas aplicaciones de importancia de estas. Preparar una reacción de digestión de DNA con enzimas de restricción

Introducción:Vectores 70’s: se crean exitosamente las primeras moléculas recombinantes Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células Una vez en célula huésped, se replica produce varias copias idénticas del gene se expresa esto se le llama clonación.

Introducción: vectores Para clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene. Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables Ori Secuencias marcador MCS (molécula pequeña de DNA que es capaz de replicarse independiente del cromosoma del hospedero, y de producir varias copias idénticas del gen insertado

Vector

Enzimas Proteínas Aceleran reacciones químicas Reducen la E de activación E + S  ES  E + P Ejemplos Proteasas Lipasas amilasas Dehidrogenasas Girasas Ligasas Peptidasas NUCLEASAS

Enzimas de restricción Descubiertas 1970, Daniel Nathans Cortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenas Aisladas de bacterias, cientos Función: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extraño (fagos) Sistema de restricción/modificación Restricción/Metilación Nombre, quien la produce EcoRI – Escherichia coli (cepa RY13) Hind II – Haemophilus influenzae XhoI – Xanthomonas holcicola

Enzimas de restricción: Palindrome? Reconocen palíndrome, específicas Secuencia que lee lo mismo en ambas cadenas, en orientación opuesta 5’3’ 3’5’ 4, 6, 8 bp 1/256bp, 1/4096bp Isoesquisomeros ambiguos-(Py-Pu) DNA learning center

Enzimas de restricción: Cortan el enlace fosfodiester Blunts ends Enzima corta simétricamente, en sitios opuestos en ambas cadenas Sticky or cohesive ends - enzima corta asimétricamente, un pedacito SS se extiende desde el 5’ o desde el 3’ 5’ overhangs 3’ overhangs

Enzimas de restricción: Cuidados: Caras, se venden por unidades Unidad: cantidad de enzima necesaria para digerir 1µg de DNA según las condiciones del fabricante Sensitivas al calor -20oC o hielo siempre Contaminación cruzada Pipeteo: punta nueva siempre!!!

Enzimas de restricción: Reacción, mezclar y sedimentar bien. DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales 1µg/µl de volumen (no mas) Amortiguador: iones, sales, pH, distintos para cada enzima 10X  1X: dilución 1:10 con el volumen Enzima: de acuerdo al palíndrome o para averiguar si esta presente 1U/µg de DNA Agua para completar volumen Incubadora a 37oC por 30-60 minutos

Enzimas de restricción: Factores que afectan la reacción: Composición del amortiguador Fuerza iónica: [sales] y Na o K, pH (8) Temperatura de incubación 37C, termofílicas a 50-65oC Termolábiles, 25oC Metilación Cepa de E coli, asegurarse de su actividad de metilasas

Enzimas de restricción: Aplicaciones Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector Cortar vector y cortar inserto Mapas de restricción Determinar lugares de restriccion para enzimas en algun vector o en una secuencia a clonar Southern Blot Detectar la presencia de un gen o una secuencia dada en una mezcla de fragmentos de DNA cromosomal

Enzimas de restricción: Aplicaciones Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector - cortar el vector - cortar DNA fuente del inserto de interés - mezclar y ligar - transformar - cultivar en medio de selección por el antibiótico

Enzimas de restricción: Aplicaciones Mapas de restricción - aislar el vector - incubar muestras de este con la enzima de interés o con combinaciones de estas - analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños) - comparar estos con un marcador y determinar sus tamaños - deducir (lógica) el mapa del vector Tutorial

Enzimas de restricción: Aplicaciones Southern Blot Aislar genoma Cortar con enzimas Electroforesis Transferencia Incubar con sonda radioactiva Autoradiografía Cuantas copias hay en un genoma? Hay deleciones? Se parecen estos genes Zoo blot (parecido entre especies)

Enzimas de restricción: Aplicaciones Southern Blot Edward Southern -1975 cuantas copias de un gen hay en un genoma? detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico) identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común. identificar genes homólogos en distintas especies el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad

Enzimas de restricción: Materiales Microtubos Micropipetas y puntas Incubadora Agua ultrapura DNA a cortar (x ugs) Buffer de la enzima de restricción Enzima de restricción Hielo

Enzimas de restricción: Protocolo 1. Analizar la reacción a realizar 2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos 3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, según aplique. 4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción 5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo 6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden: Agua Buffer DNA Enzima

Enzimas de restricción: Protocolo 7. Mezclar con finger-vortex 8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg 9. Incubar por 1 hora a 37oC 10. Guardar a -20oC 11. Analizar por electroforesis de agarosa. Ejemplo de Reacción Reactivo Conc Inicial Conc Final Vol (µl) Buffer 10X 1X 4 DNA 4µg/µl 0.5 Enzima 10U/µl Agua 35 Total 40 Enzima, Minimo 1U/µg DNA. Maximo 1µg/µl

Preguntas Como es mas específico para clonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencione ventajas o desventajas de cada forma. Si una enzima viene a 22000 U/ml, cuantos µl necesito para digerir 4 µg de DNA? Porque las bacterias no digieren su propio DNA con sus enzimas de restricción? Derive una formula para calcular cuantos fragmentos de DNA salen de una molécula de DNA cortada con una enzima de restricción, si la molécula es lineal vs si es circular?

Referencias Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc. Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York. http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction. html http://www.restrictionmapper.org/ http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotec h/enzymes/renzymes.html