Aislamiento de Acidos Nucleicos: Fagos Aníbal Valentín, PhD, JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología y Biotecnología Universidad de Puerto Rico, Aguadilla

Objetivos Aplicar el métodos de aislamiento de ácidos nucleicos con fenol/cloroformo para extracción de DNA de fagos. Describir las funciones de las diferentes soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos. Realizar una extracción de DNA fago M13 utilizando los método de fenol - cloroformo. 

Introducción Los ácidos nucleicos y las proteínas se encuentran bajo estudio constantemente. Los problemas asociados con el estudio de estas son particulares y únicos para cada uno: DNA, RNA, proteínas Nos centraremos en el estudio de las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos.

Lísis El rompimiento o lísis celular es el primer paso para obtener el DNA genómico. Varias técnicas son utilizados para provocar lísis celular. Entre ellas se encuentran: lisis hipotónica   lisis enzimática.

Métodos: Lisis Hipotónica Se utiliza una solución hipotónica que causa la hinchazón de la célula y el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular. Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a degradar los  lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e. Tween 20 y Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y detergentes iónicos i.e. SDS para células con pared celular o cutícula externa que la protege)   

Métodos: Lisis Enzimática Se utilizan las mismas soluciones y detergentes anteriormente mencionados además de enzimas que catalizan la reacción. La función principal de la enzima es la degradación de los peptidoglicanos presentes en la pared celular. Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran lisozima y proteinasa K.     

Métodos: Extracción Fenólica Posterior a la lísis se realiza una extracción fenólica. Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el DNA. El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases separadas cuando se tratan de mezclar. Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo, las proteínas se mueven a la fase orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el DNA en la fase acuosa. La fase acuosa con el DNA se remueve y el DNA es precipitado utilizando etanol y sales.

Extracción Fenólica

Materiales Lavado de placas y plugs Centrífuga clínica Fenol/Cloroformo/Isoamil Isopropanol Etanol al 70 Microcentrifuga refrigerada Cristaleria Micropipetas Microtubos de 1.5 ml Pipetas desechables Vortex Propipetas Puntas para micropipetas Microtubos

Protocolo Colectar ~500uL del medio que contiene el M13 aislado del plug de agar. 1. Añadir 500uL de phenol/cloroformo/alcohol isoamílico saturado con Tris 2. Mezclar bien/vortex por 30 segundos 3. Centrifugar a 12,000rpm por 5 min 4. Recolectar la fase acuosa (~450uL) y transferir a un microtubo 5. Proceder con la precipitación por isopropanol 6. Separar la muestra anterior en 2 microtubos (~200uL c/u) 7. Añadir 1/10 parte del volumen de 3M Acetato de Sodio, pH 4.8

Protocolo 8. Mezclar bien 9. Añadir 0.7X el volumen de 100% isopropanol (frío) ~160uL 10. Centrifugar a 12,000rpm por 30min a 4oC 11. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando atención al “pellet” de ácido nucleico. 12. Añadir 1mL de 70% etanol 13. Centrifugar a 12,000rpm por 10min a 4oC

Protocolo 14. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando atención al “pellet” de ácido nucleico. Si es necesario, una vez descartado el 70% etanol, volver a centrifugar por 30 segundos a 12,000 y remover los residuos de etanol utilizando un micropipeta sin perturbar el pellet 15. Incubar el microtubo que contiene el ácido nucleico a temperatura ambiente y abierto durante 10-15min Permitir que los residuos de etanol se evaporen 16. Resuspender el ácido nucleico en 25uL de agua destilada 17. Guardar a -20oC 2 750 + 750 4 500 + 500 6 500 27 + 473

Preguntas Para que es el fenol? Para que es el cloroformo? Para que es el alcohol isoamilico? Para que es el Acetato?   Para que es el isopropanol? Para que es el etanol? Para que es el agua?

Virtual Labs DNA Extraction Plant DNA Extraction