Human Mediator Enhances Basal Transcription by Facilitating Recruitment of Transcription Factor IIB during Preinitiation Complex Assembly. “Mediador humano incrementa la transcripción basal facilitando el reclutamiento del factor de trascripción IIB durante el ensamblado del complejo preiniciador”. Hwa Jin Baek, Yun Kyoung Kang, and Robert G. Roeder Fromthe Laboratory of Biochemistry andMolecular Biology, Rockefeller University, New York, New York Oradores: Velez, Leandro; Vega, Fernando; Bochicchio, Pablo.

Hasta ahora sabemos que… Factores generales de transcripción

Hasta ahora sabemos que… Adaptado de Kim, JL y col., Nature, 1993; 365:520.

TFIIH Helicasa Fosforila en múltiples sitios el CTD de la Pol II

El mediador se asocia con la región CTD de la Pol II La región CTD es requerida para la interacción Mediador- Pol II La fosforilación del CTD mediante la acción del IIH facilita la disociación del mediador con la pol II.

Entonces: La trascripción en genes eucariotas es mediada por la interacción entre factores de transcripción con un núcleo promotor en común (ej.: TATA box) y regulado por factores de genes específicos unidos lejos de los elementos regulatorios. La pol II y varios factores de transcripción son necesarios para trascripción basal (activador independiente) Para una trascripción activador dependiente se requiere de cofactores adicionales, como la multisubunidad del complejo mediador El mediador sirve como un puente entre los factores de regulación unidos al DNA y la maquinaria de transcripción general, favoreciendo la formación o función del PIC. Mutaciones en la subunidad mediadora reducen la transcripción basal: posible implicación en la transcripción basal.

El mediador en levaduras promueve mediante el TFIIH la fosforilación de la cola CTD de la pol II En humanos el mediador y el TFIID actúan cooperativamente en el ensamblado del PIC activador dependiente. El mediador interactúa tanto con la pol II como con los factores generales de trascripción para facilitar la formación y el funcionamiento del PIC La vía de formación basal del PIC es idéntica a la vía con factores purificados, en esta vía la unión de TFIIB a TBP es critica para el reclutado de pol II. Hay cooperatividad en la formación del PIC entre el mediador y el TFIIB La interacción entre el mediador -TFIID y mediador – pol II puede que determine la necesidad de la interacción de TFIID con la pol II. La interacción mediador- TFIID y mediador- pol II resulta en una menor dependencia del reclutamiento de TFIIB por la pol II.

Disparadores que llevaron al trabajo: Redundancia o cooperatividad entre TFIIB y el mediador en la formación del PIC. Ensayos de inmunoprecipitación demostraron que el mediador y pol II no están simultáneamente.

Materiales y métodos Purificación de GTF’s TBP, TF2B y RAP74 (subunidad de TF2F): purificado de bacterias que expresan histidina”tagged” TBP, histidina “tagged” TF2B e histidina “tagged” RAP74, con el uso secuencial de: - Columna de ácido nitrilotriacetico (con níquel) unido a la agarosa (para TBP, TF2B y RAP74)(figura ) - Cromatografía en heparina-sefarosa (la heparina interacciona específicamente con proteinas) (para TBP) Figura : modelo de una columna similar A la utilizada en el experimento. RC: proteína de interés His: histidina NTA: ácido nitrilotriacetico

TF2D: purificado de una línea celular que expresa el epitope FLAG “tagged” TBP (se aísla el complejo TBP con las TAF’s). Mediadores: NUT2 y TRAP220AB aislados de líneas celulares que expresan un epitope FLAG “tagged”MED10(NUT2) y un epitope FLAG “tagged”MED1 (TRAP220AB) Templados de ADN inmovilizados Útil para estudiar la iniciación, elongación y terminación de la trascripción. Con esta técnica, es posible separar físicamente o cinéticamente estas 3 fases. El templado a utilizar se obtiene mediante una reacción de PCR convencional excepto por el hecho de que uno de los primers (el forward) esta marcado con biótina en su extremo 5’. Luego se agrega el templado amplificado resultante de la PCR a una solucion concentrada de particulas paramagneticas conteniendo estreptadivina, y ya que la estreptadivina tiene una alta afinidad por la biotina,se produce la ligacion de las particulas con el Templado. Por ultimo, las partículas paramagnéticas son atraídas por “imanes” y de esta forma quedar aislados del medio.

o Diagrama esquemático de la Técnica del ADN inmovilizado FIGURE. experimental scheme.Two different bead-immobilized templates with intact (iML53TATA)and mutated (iML53TATA) TATA boxes were prepared from an adenovirus major late core promoter (TATA and Inr) construct with a downstream G-less cassette (13).

Trascripción In Vitro con templados inmovilizados Las reacciones de trascripción se llevan a cabo incubando el templado inmovilizado con extractos nucleares de HeLa (células proveniente del cérvix o cuello Uterino) en presencia de [ α -32P]UTP, CTP, GTP y ATP. Las reacciones se detienen con la extracción de los ácidos nucleicos por agregado de una solución stop con fenol-cloroformo, y posteriormente se precipitan con el agregado de etanol para ser analizados los productos. Análisis de proteínas en los templados inmovilizados Luego de la incubación de los extractos con el templado inmovilizado, se resuspenden los templados en una solución conteniendo EcoR1, con lo cual se liberan las proteínas juntas al templado, y se analizan por medio de un gel de poliacrilamida y posterior inmunoblotting.

Inmunodepletado de extractos nucleares Se prepararon extractos nucleares depletados en Mediador (NEΔMED) o en TF2D y Mediador (NEΔ2D ΔMED), en TF2B (NEΔ2B) y en TF2B,TF2D,y Mediador (NEΔ2B Δ2D ΔMED).

Resultados El mediador no es necesario in vitro para la transcripción, en cambio en un extracto si es necesario. Como el ensamblaje del complejo PIC es esencial y limitante de la transcripción, se estudio la posibilidad de que el mediador aumentara la transcripción basal interactuando con el PIC Templates were incubated with NE(IID/MED) supplemented with amounts of TBP and Mediator(f:TRAP220AB) comparable with the levels in the control extract as indicated. For transcription reactions, immobilized templates were washed and analyzed as described under “Materials and Methods.” For immunoblot analyses, reactions after incubation were were washed (the immobilized templates), digested with EcoRI, and subjected to immunoblotting

TBP,TF2B,TF2E,Pol2 y el Mediador Son reclutados solo en presencia de TATA. Mas aun, TF2B,TF2E, y Pol2 se Logra en presencia de Mediador. TF2H y TF2F se unen en ausencia o Presencia de TATA (calle 2) y Mediador (calle 4). Esto estaria reflejando la Posible dependencia del Mediador en El reclutamiento al PIC, de estos dos Factores. Este resultado demuestra que evidentemente el Mediador cumple un rol importante en el reclutamiento de (por lo menos) TF2B, TF2E y Pol2 al PIC. Resultados

La trascripción basal depende exclusivamente De la presencia de TATA. La presencia de Mediador aumenta aprox. 5 veces La trascripción Entonces, la trascripción basal dependiente de Mediador en los NE se correlaciona con el reclutamiento dependiente de mediador de los factores (Pol2, TF2E,TF2B). La contribución del Mediador en la trascripción basal puede Estar subestimada, ya que en los ensayos se utiliza TBP y no TF2D (ya que In Vivo se observa que las TAF’s son Importantes en la trascripción basal)

La actividad de transcripci ó n basal mediador dependiente en extractos nucleares esta mutuamente relacionado con el reclutamiento de Factores mediador dependiente en la formaci ó n del PIC. Protocolo básico: Objetivo del ensayo: Comparar el reclutamiento de factores de transcripción con la adquisición de actividad transcripcional en función del tiempo.

La actividad transcripcional aumenta linealmente con el tiempoLa actividad transcripcional aumenta linealmente con el tiempo Observan el producto de trascripción (Δ53) en función del tiempo, a partir del templado inmovilizado iML Δ53TATA+.

Curso del tiempo del reclutado de los factores de transcripción El reclutamiento de los factores FTIIB, FTIIE, el mediador y pol II (RPB1)muestran un incremento en el mismo periodo. TFIIH y TBP muestran una unión fuerte y constante en el tiempo.

Conclusión general del ensayo: La cercana correlación entre la formación funcional del PIC (medida en el ensayo como actividad transcripcional) y el reclutamiento del mediador y componentes clave del PIC, apoyan la hipótesis de que el reclutamiento de componentes del PIC dependiente de mediador gobierna el nivel de transcripción basal en extracto nuclear.

Plan experimental. Un templado inmovilizado (iG5HML) conteniendo 5 copias del sitio de unión Gal4. El templado iG5HML fue incubado 1 hora a 30ºC con extracto nuclear (ΔMED) solo o con el Mediador (f:TRAP220AB) en presencia o ausencia de Gal4-VP16. Después del lavado, el templado fue sometido a la transcripción in vitro y ensayos de inmunoblot. Contribución del Mediador en la transcripción dependiente de activador

Resultados Reclutamiento de los factores de transcripción. iG5HML fue incubado con Extracto Nuclear (ΔMED) con Mediador(f:TRAP220AB) y/o Gal4-VP16 como se indica, y los factores unidos fueron ensayados con anticuerpos a proteínas indicadas a la derecha. Con Mediador, Gal4-VP16 aumenta el reclutamiento de pol II, TFIIF y TFIIE, tan efectivamente como el Mediador solo. En contraste, en ausencia del mediador, Gal4-VP16 aumento el reclutamiento a un nivel mucho menos eficientemente.

Actividad de transcripción de los templados. Con Mediador y Gal4-VP16 se elevo unas 44 veces, que bajo a solo 10 veces cuando tenemos solo el activador Gal4-VP16 o el Mediador. Mediador parece proveer un importante vínculo que es necesario para que el activador pueda reclutar pol II y GTFs al promotor en el contexto del extracto nuclear.

Conclusiones del ensayo: La dependencia del Mediador para reclutar GTFs y pol II parece ser relevante tanto en la transcripción basal como en una transcripción dependiente de un activador en extracto nuclear.

Elevados niveles de TFIIB pueden saltear el requerimiento normal del mediador para el ensamblado del PIC y transcripción basal en extractos de núcleo. TFIIB tiene rol directo en el reclutamiento de pol II en el PIC. El mediador recluta la pol II para la formación del PIC. Ambos son necesarios para el reclutamiento en extractos nucleares y no en sistemas purificados. Posible función similar de TFIIB y el mediador en el reclutamiento de la pol II. Estudios anteriores demostraron que:

Estos resultados sugiere algunas diferencias en las vías de ensamblado del PIC. Una posibilidad es que el extracto contenga un factor o factores que inhiban el reclutamiento del TFIIB al PIC y que el mediador, directa o indirectamente contrarreste la actividad inhibitoria del factor. Un nivel mayor concentración de FTIIB puede que resulte en un efecto inhibitorio sin la ayuda del mediador.

La transcripción basal fue medida en extractos nucleares depletados de mediador con agregado de TFIIB. Observan que recupera los niveles normales de transcripción luego de añadir un exceso 25 molar.

La adición de 25x de TFIIB promueve significativamente el reclutado de TFIIE y pol II El exceso promueve el ensamblado del PIC, al igual que lo hace el mediador en la activación basal de la transcripción. Ensayan en reclutado de factores por adición de FTIIB.

Exceso de TFIIF no tiene efectos sobre la transcripción basal. Fue hecho a modo de control para enfatizar puenteo de TFIIB sobre el mediador. Ensayo control del A

Ensayo reciproco al A. Hay un pequeño aumento de la transcripción con exceso de 10x. Demuestra que no es reciproca la acción y que es propio de TFIIB.

Repiten el ensayo pero ahora con un templado ΔIID/MED, con agregado de TBP En la calle 4 se observa el puenteo por parte del exceso de TFIIB.

Exceso de TFIIF no tiene efectos sobre la transcripción basal. (calle 4) Fue hecho a modo de control para enfatizar puenteo de TFIIB sobre el mediador.

Conclusiones del ensayo: Exceso de TFIIB promueve significativamente el reclutado de TFIIE y pol II Los factores asociados a las proteínas de unión a región TATA (TAF) no son esenciales, tanto para el mediador como para el exceso de TFIIB a fin de que ocurra una transcripción basal en extracto de núcleos ΔMED. Solo se necesita del dominio TBP

Preparación de extracto nuclear sin TFIIB. Se ve que solo se saca el TFIIB en el ensayo de la 3º calle. El rol de la TFIIB en el reclutamiento de la pol II y TFIIE al promotor en la transcripción basal

Ensayos de transcripción común fueron realizados con G5HML y adenovirus con plásmidos Δ53 en el extracto nuclear control o en NE(ΔIIB) complementada con varias cantidades de TFIIB recombinantes (rTFIIB). La reacción en la línea 5 contiene una cantidad de TFIIB recombinante comparable con la endógena. Dependencia de TFIIB en la transcripción basal en E.N. sin TFIIB Sin TFIIB se ve una significante reducción en la transcripción basal que fue completamente restablecido con la adición de TFIIB al nivel equivalente de un extracto nuclear normal.

Para evaluar el rol de la TFIIB en el reclutamiento de la pol II en el extracto nuclear, en el cual la transcripción basal y el reclutamiento de la pol II son dependientes del Mediador, el extracto sin TFIIB fue usado para el reclutamiento de factores y la transcripción por el templado inmovilizado.

Se ve que el reclutamiento de TFIIE y la pol II disminuyo sin TFIIB, pero que este aumenta con el agregado de TFIIB Este efecto del TFIIB sobre el ensablado del PIC fue reflejado en la transcripción basal del templado inmovilizado. La transcripción gue aumentada 16 veces con la adición de TFIIB

Ensayo con un templado inmovilizado muestra que TFIIB no es requerido para el reclutamiento del Mediador en E. N. Ensayo con templado inmovilizado que muestra la necesidad de TFIIB para la transcripción basal

Conclusiones del ensayo: A pesar de la importancia del Mediador, TFIIB es esencial para la transcripción basal y el ensamblado del PIC en un extracto nuclear crudo o en uno purificado. Pero estos ensayos no tienen en cuenta las funciones cooperativas entre el Mediador y TFIIB en el reclutamiento de pol II; y además, los resultados muestran que, aunque el reclutamiento de la TFIIB es dependiente del Mediador, el reclutamiento del Mediador no depende de la TFIIB.

La formación de un complejo de TFIID-Mediador-Promotor es un paso limitante en la transcripción basal. Ensayo: una preincubación de 30 minutos del templado con TFIID en presencia o ausencia del Mediador fue seguido por una preincubación por tiempo t en extracto nuclear (ΔIID/ΔMED) sin mediador y, si fue omitido en el paso 1, con agregado de mediador.

La actividad de transcripción del templado inmovilizado que fue preincubado solamente con TFIID en el primer paso incremento al menos linealmente con los tiempos de incubación. En contraste, la transcripción del templado inmovilizado que fue preincubado con TFIID y Mediador en el primer paso seguido de una corta incubación (10 min.) en el segundo paso fue alta inmediatamente

De este resultado, puede inferirse que la actividad de la transcripción del templado pre-tratado con TFIID era determinado por el tiempo gastado en el reclutamiento del Mediador al promotor. Así, el ensamblaje del TFIID y el Mediador al complejo del promotor parase ser un paso limitante en la transcripción y un prerrequisito para el reclutamiento de otros factores para la formación de un PIC funcional. Ploteado de los resultados anteriores

Un análisis similar en el cual TFIID sustituido por TBP no mostró un aumento en el reclutamiento del Mediador, indicando así el rol de la dependencia de la TFIID en el reclutamiento del Mediador. Ensayo de templado inmovilizado con una incubación con Mediador y en presencia o ausencia de TFDII, seguido de un inmubobloting para ver el pegado de las proteínas. el reclutamiento del Mediador al templado fue incrementado de 3 a 4 veces sin y con TFIID. Además, parece que el Mediador y la TFIID interactúan directamente en el contexto del templado de ADN.

Discusión y conclusiones El mediador intensifica la transcripción basal, facilitando el reclutamiento de la pol II y correspondientes factores iniciadores (minimamente IIB y IIE). El efecto del mediador (coactivador) se observa in vivo, puede deberse a presencia de inhibidores de la transcripción basal en el extracto, posible presencia de cofactores negativos. Elevados niveles de TFIIB ectópicos pueden saltear la necesidad del mediador para la transcripción y reclutamiento de la pol II. En extractos ausentes de mediador los niveles de reclutamiento de IIB y subsiguiente función en el ensamblado del PIC es mínimo, esto se debe a la baja concentración natural o a la presencias de cofactores negativos.

Se demostró que la presencia de THIIB es imprescindible para la transcripción. Y además, la dependencia del Mediador para su reclutamiento. Aunque estos resultados no excluyen los efectos cooperativos del Mediador y TFIIB en el reclutamiento de la pol II. El aumento de la transcripción en los ensayos con TFIID y Mediador pueden conducir a la idea de la necesidad de una interacción entre el Mediador y TFIID, siendo este paso el limitante para el reclutamiento de los GTFs. Discusión y conclusiones