Christian Solis Calero Biofaral@hotmail.com Universidad Nacional Mayor de SanMarcos Facultad de Farmacía y Bioquímica APROXIMACION BIOINFORMATICA A LA IDENTIFICACION DE DIANAS FARMACOLOGICAS EXPRESADAS DURANTE EL ESTADO DE LATENCIA DE Mycobacterium tuberculosis Christian Solis Calero Biofaral@hotmail.com Lima- Perú 2003 Por Christian Solís Calero Facultad de Farmacía y Bioquímica. UNMSM, Octubre 2003

Indice Introdución Bioinformática Genómica Mycobacterium tuberculosis Antecedentes Objetivos Metodología Resultados Conclusiones Agradecimientos

BIOINFORMÁTICA Bioinformática es la aplicación de la tecnología de la información a la bioquímica y la biología molecular

Procesamiento Computacional Procesamiento de SEÑALES Procesamiento de DATOS Procesamiento de CONOCIMIENTO MUESTRAS DATOS PREDICCION INFORMACION Secuencia de aminoácidos Estructura tridimensional De Proteína Secuencia correspondiente a un gen Secuencia de nucleótidos (DNA)

Mycobacterium tuberculosis Agente etiológico de la Tuberculosis, la enfermedad infecciosa que más muertes provoca en el mundo. La Tuberculosis es un complejo de Fenómenos microbiológicos e Inmunológicos que escapa a una definición simple. Nuevos Problemas: Asociación con la infección del virus del SIDA Resistencia a la acción de los farmacos. El Mycobacterium tuberculosis es capaz de causar tanto un proceso agudo de enfermedad como una infección latente asintomática. un tercio de la población mundial puede estar infectada con el bacilo en este estado

Enfermedad sístemica progresiva y muerte Infección en los alveolos Los bacilos se multiplican y se movilizan hacia los ganglios linfáticos traqueobronquiales Hipersensibilidad de tipo retardado e inmunidad mediada por células Positividad conla tuberculina Se contiene la enfermedad Las Bacterias viven pero no se multiplican El complejo de Ghon aparece en una fase temprana en el 15% de los casos De estos 91% sin enfermedad 6% TBC Clínica - 2% Pulmonar - 3% extratorácica - 1% ambos casos 3% Enfermedad sistémica Progresiva y Muerte. Poca o ninguna hipersensibilidad. Negátividad con la tuberculina Enfermedad sístemica progresiva y muerte LATENCIA

Vencer las resistencias Genoma Nature 393, 537-544 (1998) Mycobacterium tuberculosis GENÓMICA BIOINFORMATICA PROTEÓMICA BIOLOGIA ESTRUCTURAL Nuevos Fármacos Vencer las resistencias Vacunas

ANTECEDENTES Publicación del genóma de Mycobacterium tuberculosis Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. S. T. Cole, y Col Nature 393, 537-544 (1998) McKinney, J y Col (2000) señalan que la latencia esta asociada a la expresión del gen para la isocitrato liasa que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos. Nature, 2000; 406: 735-38. Glickman, M. Y Col (2000) encuentran una relación directa entre la latencia y la expresión de un gen involucrado en la síntesis de anillos de ciclopropano del ácido micólico. Mol. Cell., 2000; 5: 1-20.

OBJETIVOS - Hacer un inventario de las posibles dianas farmacológicas relacionadas al estado de latencia de Mycobacterium tuberculosis. - Evaluar la factibilidad de las posibles dianas farmacológicas en base al análisis del genóma del Mycobacterium tuberculosis. - Predecir y evaluar las estructuras tridimensionales de las posibles dianas farmacológicas usando herramientas bioinformáticas.

METODOLOGIA Medline Análisis Genómico Predicción Estructura 3D KEGG Biblioteca de Genes y Genómas Fasta Z TubercuList Web Server Fasta output Regiones del genóma de M tuberculosis similares al gen de la posible Diana Regiones de otros genomas similares al gen de la posible Diana METODOLOGIA Información Bibliográfica Medline Posibles Dianas Farmacológicas Secuencias de aminoácidos Entrez ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Predicción Estructura 3D 3D-pssm Módelado por Homología Si/No Módelado por Threading Módelo 3D SWISS-MODEL 3D NCBI Blast-P

National Center for Biotechnology Information U.S. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.kegg.com/

TubercuList World-Wide Web Server. Institut Pasteur, 1999-2001 http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/

3D-PSSM Protein Fold Recognition (Threading) Server http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/

Estructura tridimensional DIANAS DE PARED GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función dapB Dihidrodipicolinato reductasa NP_217289 Si Sulfonamidas Biosíntesi de diaminopimelato wbbL ramnosil transferasa CAB07092 No No conocido crecimiento de la bacteria/capa de arabinogalactano Rv3264c D-manosa-1-fosfato guanidiltransferasa CAC30262 acpM AcpM ( acyl carrier protein del patógeno). NP_216760 Isoniazida Llevar los intermediarios de las enzimas del sistema FasII InhA enoil-ACP reductasa NP_216000   KasA beta-cetoacil-ACP sintasa CAA94641 Isoniazida, cerulenina y tiolactomicina Parte Operon sistema FAS II (elongar los productos de FAS I) KasB NP_216762 cerulenina y tiolactomicina pks2 Síntesis de ácidos grasos con múltiples ramificaciones de grupos metil NP_218342 Se expresa en aquellas cepas de M.tuberculosis capaces de proliferar en macrófagos FBPB Antígeno 85B/micoliltransferasas P31952 La síntesis de la pared/localización extracelular fbpC antígeno 85C/micoliltransferasas P31953 CMAA2 Acido micolico ciclopropano sintasa (CMAS) Q11196 introducción de cis-ciclopropano en dos posiciones de la cadena alfa-alquil de los ácidos micólicos mtfabD malonil CoA-ACP transacetilasa (MCAT). NP_855916 biosíntesis de ácidos grasos EmbA P72060 EmbB síntasa de la porción arabinán de la fracción de arabinogalactán NP_218312 Etambutol biosíntesis de la fracción galactán del complejo micolil-arabinogalactán Rv3808c(glft) UDP-galactofuranosiltransferasa CAA17872 Síntetasa de ácdo micolicos NP_214984 umaA2 elongación de ácidos grasos FASII Esencial Esencial

Estructura tridimensional DIANAS PROPIAS DEL ESTADO DE LATENCIA GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función cluster génico narGHIJ (ej: NarG) Complejo nitrato reductasa NP_215677 No No conocido proteínas respiratorias/vías de respiración del nitrato hmp Dioxigenasa que cataliza la transformación del NO a nitrato NP_857241 respuesta al estrés acr la alfa-cristalina AAM69206 Condiciones Anaerobias / asociada al engrosamiento de la pared, estabilizando así la estructura celular aceA Isocitrato liasa (ICL) NP_336424 Si adaptación a las condiciones de microaerofilia/imprescindible para el mantenimiento del estado de latencia glcB Malato sintetasa CAB01465 KatG Catalasa-peroxidasa Q08129 defensa antioxidante/oxida la Isoniazida adaptación a las condiciones de microaerofilia

Estructura tridimensional OTRAS POSIBLES DIANAS FARMACOLÓGICAS GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función NusA factor de trascripción (de elongación) CAB08449 Si Se une a la RNA polimerasa regulación transcripción rRNA. No conocido Rv2276 citocromo P450 (monooxigenasa) Q59571 Miconidazol, Clotrimazol Degradación de ciertos compuestos xenobióticos EfpA bomba de protones NP_217362 No Expresión es inducida en presencia de Isoniazida Fola Dihidrofolato reductasa O33305 Esencial para la síntesis de nucleótidos y varios aminoácidos (como met, ser y gly); quinol quinolonic-ácido ribosiltransferasa (QAPRTasa)   enzima clave para la biosíntesis del NAD

RESULTADOS

Búsqueda de secuencias similares en el Genóma de Mycobacterium tuberculosis Posición en la secuencía de aa Posición en le genóma de M tuberculosis Z-score E value acr 01--86 764.7 8.80E-41 302485-302366 aceA Cristalografia 2160461-2161345 174-275 276 1.40E-13   2086979-2084757 KatG 1-740 7142.9 0.00E+00 Hmp 1-358 4012414-4013487 1608.8 8.40E-88 narG 1-1232 1287326-1291021 Gen Segmentos de nucleótidos con similaridad Parametros Fasta Z Modelaje de estructura 3D 2278849-2278592 Modelaje comparativo 26-61 101.8 0.00073 295-608 2161342-2162283 1637.8 2.00E-89 1-295 1512.5 1.90E-82 557972-558277 glcB 1-741 7304.5 2156109-2153890 17-357 3993707-3994732 274.4 1.80E-13 2231.8 1.70E-122 Modelaje comparativo   1-281 1964184-1963354 464 4.90E-24 Threading 2 regiones Similares  

Regiones en el genóma con alta similaridad

3D-PSSM Protein Fold Recognition (Threading) Server OUTPUT DEL THREADING 3D-PSSM Protein Fold Recognition (Threading) Server

PERSPECTIVAS

PubMed Análisis Genómico Presencia de secuencias Similares Zonas de la Bases de Datos secundarias Bloques de secuencia Conservados Secuencias de aminoácidos ProDom ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Análisis Genómico BUSQUEDA EN OTROS GENOMAS Fasta Z Zonas de la estructura 3D Importantes Presencia de secuencias Similares Información Cualitativa Constante de acoplamineto Ki. Chemoinformática Sculpt Ligandos Naturales Ensayos computacionalde Docking Módelo 3D AMBER PubMed Modelaje molecular AB initio 3D Proteína Sintéticos Sitio Activo

FARMACOGENÓMICA Diseño de Drogas en Base a la Estructura tridimensional de la Diana farmacológica

CONCLUSIONES Los genes aceA, glcB, NarG, acr, y KatG de Mycobacterium tuberculosis presentan secuencias de nucleótidos unicas en el genóma poco similares a otras regiones del mismo genoma. El gen hmp presenta dos segmentos de nucleótidos altamente similares en el genoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv , (que posiblemente codifiquen isoenzimas capaces de catalizar la misma reacción, lo que dificultaría el hallar un inhibidor para esta actividad catalítica). La disponibilidad de las estructuras tridimensionales obtenidas experimentalmente o por modelaje molecular comparativo de las proteínas seleccionadas como relacionados al estado de latencia, hace viable la obtención y evaluación computacional de ligandos (posibles farmacos) para estas proteínas.

Este trabajo de Investigación se realiza gracias al apoyo y auspicio de las siguientes Instituciones: Fundación Carolina Facultad de Farmacía y Bioquímica Universidad Nacional Mayor de San Marcos La Fundación Carolina de España

Añay Biofaral@hotmail.com