TEMA 2 PURIFICACIÓN DE ENZIMAS Introducción ¿Por que se purifican las enzimas? Objetivos y estrategias Reglas básicas para la selección de un proceso de purificación Evaluación de la purificación
¿POR QUE SE PURIFICAN LAS ENZIMAS? - Conocer exactamente la reacción catalizada - Mecanismos de catálisis - Parámetros cinéticos - Regulación (alosterismo, modificaciones postraduccionales, etc) - Estudios estructurales (Rayos X, RMN, Dicroismo circular óptico) - Información escalado industrial Estudio aplicaciones (diagnostico, quimica ambiental, industria, etc)
OBJETIVOS EN LA PURIFICACIÓN 1.- MÁXIMA CANTIDAD POSIBLE Porcentaje de enzima purificada respecto a la cantidad original 2.- MÁXIMA ACTIVIDAD CATALÍTICA Enzima en condiciones operativas 3.- MÁXIMA PUREZA No contenga otras proteínas, esto condiciona el uso del enzima
EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA GRADO DE PURIFICACIÓN Incremento de actividad específica respecto a la de partida RENDIMIENTO Porcentaje de enzima purificada Parámetros que se evalúan en la purificación Concentración de proteínas Actividad enzimática
Cromat Intercam. iónico Actv. (und) Cromat. exclusión Extracto celular Actividad específica Units/mg Total Prot (mg) Volum. (ml) Tabla de Purificación Grado de purificación Rendimiento -
UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Unidad internacional de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar Katal, cantidad de enzima que consume un mol de sustrato por segundo 1 kcat = UI ACTIVIDAD ESPECÍFICA Es el resultado de dividir la actividad en UI por la cantidad de proteína presente en la fracción Pureza
REGLAS BÁSICAS PARA LA SELECCIÓN DE UN PROCESO DE PURIFICACIÓN 1. Elige procesos de separación basados en las diferentes propiedades fisico-químicas 2. Elige condiciones que exploten las mayores diferencias posibles entre las propiedades de la enzima a purificar y las proteínas contaminantes 3. En el primer paso separa las mayor parte de las proteínas contaminantes 4. Usa un paso muy selectivo tan pronto como sea posible 5. El último paso se reserva para la tecnología mas costosa
Fuente Separación Purificación es un procedimiento secuencial Hay actividad? Desechar No Combinar Fracciones SI Control de pureza Ensayo de la cantidad de proteínas Ensayo de la actividad enzimática Pura? Estudios enzimáticos/estructurales, etc SI No Repetir con otra tecnica de separación Preparación Técnica de separación
FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Agentes quelantes Rarocualquiera Metales pesados Separación del inhibidor Raro Plantas y bacterias Inhibidores específicos Concentración rápida Bastante común cualquiera Dilución proteína Agentes reductores comúncualquieraoxidación Bastante común Plantas y hongos Productos oxidación de fenoles Inhibidores de proteasas o frío ComúnmayoríaProteasa CalentamientorarocualquieraFrio EnfriamientouniversalcualquieraCalor Modo de contrarrestarlo frecuencia Fuente de enzima Factor inactivante
FUENTES DE ENZIMAS 1.ABUNDANCIA DE LA ENZIMA Fuentes mucha riqueza enzimática Ej Acetil-CoA carbosilasa Glándulas mamarias Fosfatasa alcalina Riñón E. Coli Manipula genéticamente/(ambientalmente) 2. POSIBILIDAD DE OBTENCIÓN DE LA FUENTE Glándula pituitaria (buena fuente) NO fácil disponibilidad 3. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR Ubicación de la enzima muy importante para el diseño del sistema de purificación
Enzyme a a EC number b b Source Intra/extra -cellular c c Scale of production d d Industrial use Animal enzymes Catalase LiverI -Food Chymotrypsin PancreasE -Leather Lipase e e PancreasE -Food Rennet f f AbomasumsE+Cheese Trypsin PancreasE-Leather Plant enzymes Actinidin Kiwi fruitE-Food a-Amylase Malted barleyE+++Brewing b-Amylase Malted barleyE+++Brewing Bromelain Pineapple latexE -Brewing b-Glucanase g g Malted barleyE ++Brewing Ficin Fig latexE-Food Lipoxygenase SoybeansI-Food Papain Pawpaw latexE++Meat Bacterial enzymes a-Amylase BacillusE+++Starch b-Amylase BacillusE+Starch Asparaginase Escherichia coliI-Health Glucose isomerase h h BacillusI++Fructose syrup Penicillin amidase BacillusI-Pharmaceutical Protease i i BacillusE+++Detergent Pullulanase j j KlebsiellaE-Starch Fungal enzymes a-Amylase AspergillusE++Baking Aminoacylase AspergillusI-Pharmaceutical Glucoamylase k k AspergillusE+++Starch Catalase AspergillusI-Food Cellulase TrichodermaE-Waste Dextranase PenicilliumE-Food Glucose oxidase AspergillusI-Food Lactase l l AspergillusE-Dairy Lipase e e RhizopusE-Food Rennet m m Mucor mieheiE++Cheese Pectinase n n AspergillusE++Drinks Pectin lyase AspergillusE-Drinks Protease m m AspergillusE+Baking Raffinase o o MortierellaI-Food Yeast enzymes Invertase p p SaccharomycesI/E -Confectionery Lactase l l KluyveromycesI/E-Dairy Lipase e e CandidaE-Food Raffinase o o SaccharomycesI-Food
Células, tejidos,etc Rúptura Pellet con células intactas, organulos, membranas y proteínas de membrana Sobrenadante con proteínas solubles OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO Enzimas intracelulares es necesario la ruptura celular Células sin pared rígida (tejido de mamiferos) Fácil (Pistilo giratorio) Células de pared rígida (plantas, hongos, bacterias, etc). a) Desecación b) Cizalla líquida a presión. Prensa French, Fraccionador de Sorvall-Ribi, etc c) Cizalla líquida con abrasivos. Bolas de vidrio 0,1 mm bacterias, 0,5 mm levaduras d) Sonicación (bacterias) e) Enzimas Líticas Lisozima, quitinasas, glucanasas, etc. f) Tratamientos químicos Detergentes, solventes orgánicos (tolueno,acetona, etc) agentes caotrópicos (Urea, Guanidina, etc)
ELIMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Inclusión dependerá - De la cantidad de ácidos nucleicos - Del uso del enzima (uso terapéutico debe estar libre) Eliminación es conveniente _ Interacciona con la enzima (agrega) Viscosidad del medio (impide manipulación, en procesos de filtración, centrifugación, etc). METODO DE ELIMINACIÓN Adición de policationes Estreptomicina Proteína básica (protamina) Polietilamina (polímero catiónico) Enzimas (NUCLEASAS)
PROPIEDADES FISICO-QUÍMICAS UTILIZADAS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Característica Procedimientos Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifugacion Solubilidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH Hidrofobicidad C. De interaccion hidrofóbica Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Selectividad Cromatografia de afinidad
Tamaño Diálisis ( membranas semipermeables)
Tamaño Ultrafiltracion Centrifugación en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa tubo de centrifuga Los componentes de la mezcla se separan por: Peso Tamaño Densidad Forma
Coeficiente de sedimentación S = M (1-V ) N f M: peso molecular V: Volumen espécifico : densidad de la solución N : numero de avogadro F: coeficiente de fricción Las proteinas migran de forma proporcional a este coeficiente
Cromatografía de filtración Las columnas rellenas polimeros inertes Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano Tamaño
. 1.La columna se equilibra con el buffer de corrido 2. Aplicación de la muestra ( % volumen de columna) 3. Elución. Exclusión molecular Separa mezclas de proteínas por tamaño
Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Kav Log Mw
Tarea La enzima pepsina y grupo de marcadores fueron eluidos de una columna de sephadex. Los volumenes de elución junto con los marcadores moleculares son los siguientes. Determina el peso molecular de la pepsina ?127Pepsina Citocromo C Mioglobina Chimiotripsinogeno Ovoalbumina Albúmina PESO MOLECULARVOLUMEN ELUCION ml Proteína
Solubilidad Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación Mantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividad Proteina composicion de aa le otorga un comportamiento La solubilidad de la proteína depende: Interacción intraproteina Interaccíon proteína-proteína Interacción proteína- disolvente
Interacciones mencionadas dependen de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura Solubilidad
Solubilidad-pH La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero pI Solubilidad es minina Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)
Solubilidad-pH
Solubilidad-Fuerza iónica Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) aumenta con la [ sales] Salting in La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting out La alta [sal] elimina la esfera de solvatación de la proteína Las proteínas en H 2 O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos precipitan Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contraiones más soluble por > interacción prot-solv Capturan el H 2 O y > interacción prot-prot.
Solubilidad-Disolventes Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) Se usan en distintas proporciones Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas
Solubilidad- Temperatura 0-40 o C >T > solubilidad o C aumenta la inestab y DESNATURALIZAN ( solubilidad)
Carga Carga y signo depende de las proteínas Cromatografía de intercambio iónico Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7 Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta. Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7 Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.
Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas Intercambio iónico
Soportes cromatográficos
ISOELECTROENFOQUE Carga
Hidrofobicidad Cromatografía de hidrofobicidad fracciona a las proteínas explotando los diferentes grados de hidrofobicidad superficial de las proteínas. Las muestras se cargan con una alta fuerza iónica La elución se produce con un gradiente de fuerza iónica negativa, se pueden incluir detergentes o sustancias orgánicas Tipo de resina, consiste en partes hidrofóbicas unidas a una matriz inerte Fenil-Sefarosa, octil sefarosa
Selectividad Cromatografía afinidad Método más poderoso y selectivo Ligando: Sustrato, Cofactor, Inhibidor, Anticuerpo, etc Elución: Bajando el pH, aumentando fuerza iónica, incluir ligando soluble, etc Problemas: No se puede anclar el ligando El anclaje produce un cambio conformacional Fuerza de unión debe ser media Inespecificidad
TEST JUZGAR EL ÉXITO DE UNA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA Test de pureza - Electroforesis en gel de acrilamida. 1D ó 2D Tinción? Plata, Comassie, Fluerescencia, etc - Isoelectroenfoque. -Espectrometria de masas Test de actividad
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Diseño de enzimas: La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese. Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula. Adición de colas de afinidad.
Tarea Después de la extracción y purificación de una enzima microbiana, esta es muy poco estable para su uso industrial. ¿Qué piensas que se puede hacer para aumentar la estabilidad?