TRABAJO PRACTICO N 2 CONTRACCION MUSCULAR EL MUSCULO COMO EL TEJIDO DE MAYOR CONSUMO ENERGETICO DEL ORGANISMO ESTUDIO DEL SISTEMA DE CONTRACCION DE LAS FIBRAS MUSCULARES

MICROANATOMIA DEL MUSCULO ESTRIADO OBJETIVO PRINCIPAL Examinar la estructura de la fibra muscular y estudiar el requerimiento químico necesario para la contracción muscular, en términos de fuentes de ENERGIA ORGANICA e IONES INORGANICOS MICROANATOMIA DEL MUSCULO ESTRIADO

FILAMENTOS GRUESOS DE MIOSINA FILAMENTOS FINOS DE ACTINA MIOFIBRILLA MIOFILAMENTOS FILAMENTOS GRUESOS DE MIOSINA FILAMENTOS FINOS DE ACTINA

RELACION ENTRE FILAMENTOS FINOS Y GRUESOS UNIDAD FUNCIONAL: EL SARCOMERO

CICLO DE CONTRACCION MUSCULAR

Ciclo de contracción animado

DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGIA PREPARACIONES PREVIAS AL TP 1) DISECCION DE MUSCULO ESTRIADO (ESQUELETICO): MUSCULO FLEXOR PSOAS MAYOR DE CONEJO. 2) INCUBACION EN 50% (V/V) DE GLICEROL / H2O A 0ºC DURANTE 24 HORAS. 3) EL MUSCULO SE TRANSFIERE A UNA SOLUCION (5 mM EDTA; 5 mM EGTA; 1 mM DTT) CON AGENTES QUELANTES DE LOS IONES CALCIO Y MAGNESIO, OVERNIGHT, REALIZANDO DURANTE ESE LAPSO VARIOS LAVADOS Y REEMPLAZO DE LA SOLUCION PARA ELIMINAR LOS IONES. 4) HOMOGENEIZACION DEL TEJIDO Y OBTENCION DE PEQUEÑOS FRAGMENTOS DE FIBRAS MUSCULARES. DESARROLLO DEL TP 5) CADA GRUPO DE ALUMNOS RECIBIRA UN TUBO EPPENDORF CON TEJIDO MUSCULAR DISGREGADO. 6) MONTAJE DE TEJIDO Y OBSERVACION AL MICROSCOPIO DE LA ESTRUCTURA MUSCULAR. IDENTIFICACION DE LA UNIDAD FUNCIONAL, EL SARCOMERO. ESQUEMA Y DESCRIPCION DE LOS COMPONENTES, OBSERVANDO DESDE EL OBJETIVO 10X HASTA 100X (ACEITE DE INMERSION) 7) ESTIMACION DEL LARGO DE UN SARCOMERO (en m) EN 5 MIOFIBRILLAS DISTINTAS MEDIR UN CONJUNTO DE 5 SARCOMEROS CONSECUTIVOS (OBJETIVO 100X). LAS MEDICIONES SE REALIZARAN EN MICROSCOPIOS CON CAMARA CLARA MEDIANTE EL USO DE TRES REGLETAS PREVIAMENTE CALIBRADAS. 2 m 4 m 8 m

EFECTO DE DIFERENTES SOLUCIONES DE PERFUSION 8) ROTULAR TODOS LOS PORTAOBJETOS. COLOCAR EN UN PORTAOBJETO UNA GOTA DE HOMOGENATO Y AGREGAR A UN COSTADO UNA O DOS GOTAS DE LA SOLUCION A TESTEAR (VER TABLA). UTILIZAR DIFERENTES PIPETAS PASTEUR PARA EL HOMOGENATO Y PARA CADA SOLUCION. MONTAR EL CUBREOBJETO, VERIFICAR QUE LA SOLUCION BAÑA EL TEJIDO, OBSERVAR EN OBJETIVO 40X EFECTO DE DIFERENTES SOLUCIONES DE PERFUSION SnP Ho 9) PARA LAS SOLUCIONES I y II, OBSERVAR EN OBJETIVO 40X Y DETERMINAR QUE OCURRE CON LA ESTRUCTURA DEL SARCOMERO DESCRIPTA INICIALMENTE (VER FIGURA 2 EN LA GUIA) . NO HAY QUE MEDIR LOS SARCOMEROS 10) PARA LAS SOLUCIONES III a VI ANALIZAR EL PROCESO DE CONTRACCION Y DETERMINAR SI SE MODIFICA EL LARGO DE UN SARCOMERO (en m), ESTIMADO PREVIAMENTE EN EL TEJIDO CONTROL. MEDIR NUEVAMENTE 5 SARCOMEROS CONSECUTIVOS EN AL MENOS 3 MIOFIBRILLAS DIFERENTES UTILIZANDO LAS REGLETAS. ESQUEMATIZAR CADA CASO Y COMPARAR CON EL CONTROL. MEDIR LOS SARCOMEROS EN OBJETIVO 100X INCORPORAR TODOS LOS DATOS A LA TABLA DE RESULTADOS

Longitud promedio del sarcómero Grupos Control Sol III Sol IV Sol V Sol VI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media ± DS

Efecto de la Solución / grado de contracción INFORME a) Calcular el largo medio de un sarcómero en estado relajado (control) y esquematizar. b) Determinar, en base a lo observado, cual es el efecto de las soluciones I y II sobre la estructura del sarcómero. Esquematizar los efectos de ambas soluciones, comparando con esquemas de miofibrillas control, en estado relajado. Indicar, de ser posible, que tipo de filamento (fino o grueso) es afectado por cada solución. c) Analizar el efecto de cada una de las soluciones III a VI sobre la contracción de las miofibrillas. Determinar el largo promedio de un sarcómero para cada solución de perfusión, indicando el efecto más probable de cada una de ellas sobre la contracción de la miofibrilla. Puede clasificar el grado de contracción muscular como: ninguno, leve, moderado o fuerte, siempre comparando con el estado relajado del portaobjeto control, que se tomará como referencia. Analizar estadísticamente los datos de todo el turno. Graficar los datos obtenidos (largo del sarcómero en función de las soluciones utilizadas). A partir de este análisis, proponga la composición más probable de cada una de las soluciones de perfusión III a VI (en este punto recuerde el objetivo del práctico) Solución de perfusión Componentes Efecto de la Solución / grado de contracción I II III IV V VI

Contracción Muscular en Psoas Mayor de Conejo