Nitrogen fixation

Como se forman los nódulos  Flavonoides se liberan de las raíces Se establece comunicación con bacterias  Activación de expresión de genes nod  Los factores nod se liberan de la bacteria e interaccionan con la raíz 

GENES DEL PROCESO SIMBIÓTICO GENES NOD DE RHIZOBIUM LOCALIZADOS DENTRO DE UN ADN CIRCULAR (PLÁSMIDO) CONOCIDO COMO SYM (PARA SIMBIOSIS) nodD = su expresión es diferencialmente afectada por los exudados de la raíz lo cual activa a: nodA, nodB y nodC = genes de nodulación comunes a todos los Rhizobium y a: nodE, nodF, nodG, nodH = genes hospedero-específico

Como se forman los nódulos  Flavonoides se liberan de las raíces Se establece comunicación con bacterias  Activación de expresión de genes nod  Los factores nod se liberan de la bacteria e interaccionan con la raíz  Activación de expresión de genes de nodulina Infección de la raíz  Formación del bacterioide/crecimiento del nódulo

NODULINAS TEMPRANAS

GENES DE NODULINAS TEMPRANAS INVOLUCRADOSEN LA INFECCIÓN DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA Y FORMACIÓN DEL PRIMORDIO DEL NÓDULO

Condiciones para la fijación de N Requiere nitrogenasa, Un reductor (ferredoxina reducida), ATP, Condiciones libres de oxígeno Controles regulatorios (ADP inhibe la reacción y el NH4+ inhibe la expresión de genes nif)

¿Porque la nitrogenasa requiere de ATP? La barrera de activación para el rompimiento del triple enlace de la molécula de N2 enorme, necesitandose de 16 ATP

To break the triple bond, energy input in necessary

NITROGENASA Genes nif estructurales y reguladores nif D y nif K Síntesis de nitrogenasa  Genes nif Genes nif estructurales y reguladores nif D y nif K MoFe-proteína nif H Fe-proteína nif F Ferredoxina Otros genes nif involucrados en la inserción del cofactor FeMo y la activación y procesamiento del complejo enzimático

Nitrogenasa Dos proteínas de diferente tamaño. Un dímero (24-36 kD) llamada Fe-proteína por contener un cluster de 4 iones Fe unidos a 4 azufres (Fe4S4) Heterotetramero de 220 kDa Llamado MoFe-proteína Cada molécula de enzima contiene cofactores Fe-Mo-S (clusters Fe4S4)

Nitrogenasa MoFe-proteína - Fe-proteína N2 + 8H+ + 16MgATP + 8e-  2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi Rendimiento Neto: N2 + 6H+ + 6e-  2NH3

Nitrogenasa MoFe-proteína - Fe-proteína N2 + 8H+ + 16MgATP + 8e-  2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi Rendimiento Neto: N2 + 6H+ + 6e-  2NH3

The nitrogenase reaction Accumulation of electrons

Complejo entre nitrogenasa reductasa y nitrogenasa

Condiciones para la fijación de N Requiere nitrogenasa, Un reductor (ferredoxina reducida), ATP, Condiciones libres de oxígeno Controles regulatorios (ADP inhibe la reacción y el NH4+ inhibe la expresión de genes nif)

La nitrogenasa es muy sensible al O2 La Fe-proteína como la MoFe-Proteína son rápidamente inactivadas por el oxígeno reduciendo su vida media de la Fe-proteína de 30 – 45 segundos y la MoFe-Proteína de 10 minutos Sin embargo el elevado requerimiento de ATP que son producidas vía respiración celular la cual solo opera eficientemente si el Oxígeno esta presente Ello plantea un conflicto por la sensibilidad de la nitrogenasa al O2

O2 Problem and Diversity Aerobes: uses O2 Cyanobacteria: O2-resistant heterocysts Methanogens: extremely anoxic environments Symbionts: co-produce O2-binding "leghemoglobin”

Hay especies de Bacterias de vida libre han retenido un estilo de vida anaeróbicas y fijan N2 en estas condiciones por lo que la producción de ATP y reductores es marcadamente menos eficiente

Las cianobacterias presentan estructuras denominadas heterocistos donde aislan el aparato metabólico de fijación de Nitrógeno y por medio de paredes celulares multicapas restringen la difusión de oxígeno y compartamentalizan la generación de ATP al interior del heterocisto. En los nódulos de leguminosas el aporte de oxígeno es regulado en gran medida por una proteína que enlaza el oxígeno (Leghemoglobina) sintetizada por la planta hospedera. La leghemoglobina controla la liberación de O2 en la región del bacteroide El componente heme de la leghemoglobina es suministrado por el bacteroide

GENES DE NODULINAS TARDÍAS INICIO DE FIJACIÓN DE NITRÓGENO Y MANTENIMIENTO Y FUNCIONAMIENTO DEL NÓDULO. LEGHEMOGLOBINA EJEMPLO DE NODULINA TARDÍA

NH4+ inhibe la expresión de genes nif) . Controles regulatorios ADP inhibe la reacción NH4+ inhibe la expresión de genes nif)

Nitrato reductasa Los electrones son transferidos desde el NADH al nitrato

Nitrato reductasa Los electrones son transferidos desde el NADH al nitrato Los complejos Mo-proteína se requieren tanto para la actividad reductasa como para el ensamblaje de las unidades de la enzima (nitrato reductasa) al dímero activo

Enzimas que contienen Mo Dos clases de molibdoenzimas Enzimas dependientes de Molibdopterina Nitrato reductasa Nitrogenasa Molibdopterina

Nitrito Reductasa La luz regula la reducción de ferredexina y flujo electrónico hacia 4Fe-4S y siroheme y de ahí hacía el nitrito El nitrito es reducido a amonio

Nitrogen fixation

En las plantas superiores, la nitrito reductasa se ubica en cloroplastos y la nitrato reductasa en citosol

La Nitrogenasa es lenta Solo 12 e- pares por segundo i.e., tres moleculas de N2 por segundo

Ademas de Rhizobium No-leguminosas –fijadoras de nitrógeno Azolla Anabaena Alnus Frankia

Two major reactions in all cells The Fate of Ammonium Two major reactions in all cells Glutamate dehydrogenase reductive amination of alpha-ketoglutarate to form glutamate Glutamine synthetase ATP-dependent amidation of gamma-carboxyl of glutamate to glutamine

The glutamate dehydrogenase reaction

The glutamine synthetase reaction

Ammonium Assimilation Two principal pathways Principal route: GDH/GS in organisms rich in N both steps assimilate N Secondary route: GS/GOGAT in organisms confronting N limitation GOGAT is glutamate synthase or glutamate:oxo-glutarate amino transferase

The glutamate dehydrogenase/glutamine synthase pathway Two N fixing steps - one inefficient One each

The glutamate synthase reaction

The glutamine synthase/GOGAT pathway One N fixing step - inefficient but expensive One NADPH Two ATP