Construcción de una biblioteca genómica Cada fragmento en un vector que entra en una célula bacteriana = libro Clonado de todos los fragmentos del genoma de un organismo = library genómica La colección de todos los clones es la library genómica

Una library genómica tiene: sec. representativas de todo el genoma N° manejable de clones fragm. clonados largos solapamiento de sec. entre los clones fácil de construir fácil de hacer el screening ser amplificables

Digestión parcial

Construcción de una biblioteca genómica Para asegurar que los fragmentos de DNA sean del tamaño adecuado para clonado Digestión con enzima de restricción con sitio de reconocimiento con 4bp Hacer digestión parcial (no todos los sitios clivados) Ligar los fragmentos al vector

Preparación del inserto

Preparación de fragmentos Digestión parcial con ER variable o tiempo variable

Library genómica Números Equivalente genómico= largo total genoma/tamaño promedio del inserto Para el genoma humano, usando un tamaño promedio de inserto de 6 kb en un vector 1 equivalente genoma = (3 x 109 bp) / (6 x 103 bp) = 5 x 105 vectores. Para el genoma humano usando un fago l de reemplazo con insertos de 20 kb 1 genome equivalent = (3 x 109 / (2 x 104 bp) = 1.5 x 105 fagos.  

N = ln(1 - 0.99)/ln(1 - (4096/3x109)) N = 3.37 x 106 clones Cálculo más preciso: Una ER six-cutter (e.g. Eco RI) cortará en promedio cada 4.1 Kb. La completa digestion de DNA humano resultará en aproximadamente 1 x 106 fragmentos únicos. Cuál es la probabilidad de encontrar un clon en una library? N = ln(1 -P)/ln(1 - f) P probabilidad deseada f fracción proporcional del genoma en un solo recombinante N número necesario de recombinantes N = ln(1 - 0.99)/ln(1 - (4096/3x109)) N = 3.37 x 106 clones

Construcción de una biblioteca genómica Vectores empleados Cosmid 30 - 45 kb Phage P1 80 - 100 kb P1 phage (PAC) 50 - 150 kb F factor (BAC) 50 - 300 kb YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica Vectores empleados Cosmid 30 - 45 kb Phage P1 80 - 100 kb P1 phage (PAC) 50 - 150 kb F factor (BAC) 50 - 300 kb YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Cosmid Cloning

Cosmid Cloning

Construcción de una biblioteca genómica Vectores empleados Cosmid 30 - 45 kb Phage P1 80 - 100 kb P1 phage (PAC) 50 - 150 kb F factor (BAC) 50 - 300 kb YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica Vectores empleados Cosmid 30 - 45 kb Phage P1 80 - 100 kb P1 phage (PAC) 50 - 150 kb F factor (BAC) 50 - 300 kb YAC (yeast) 200 - 1000 kb

BAC son derivados del plásmido F de E BAC son derivados del plásmido F de E. coli y contiene los siguientes elementos: parA y parB para asegurar una segregación apropiada oriS y repE involucrados en la replicación unidireccional un marcador que otorga resistencia a ampicilina el sitio cosN de P1 para el clivado sitio específico via P1-Ter el sitio loxP de P1 para el clivado sitio específico via P1-Cre inactivación del gen lacZ el clonado se realiza directamente en el plásmido circular (cortado con 1 ER) o en el vector cortado con 2ERs (2 brazos) la mezcla de DNA ligado se transfiere en E.coli via electroporación

Screening de una library Sondas (probes) para hibridización un gen vecino un gen relacionado evolutivamente otro miembro de la familia génica una mezcla de oligos degenerados derivados de una secuencia conservada de aminoácidos un exón conocido del gen PCR con pooles de clones