Análisis de fertilidad de los suelos PRÁCTICO N° 3 Análisis de fertilidad de los suelos Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo Técnicas mas utilizadas Abundancia de microorganismos Biomasa total Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos, nitrificadores, amonificadores, etc.) Actividad microbiana Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2) Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)

Técnicas para determinar abundancia de microorganismos Recuento de células totales Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento") Método por turbidez (Fotómetro)

Recuento de células viables En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC) Rango entre 30 – 300 colonias En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos

Recuento de células viables: grupos funcionales Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales 1) Suspensión y dilución de suelo 2) Siembra en medios selectivos 3) Determinación del crecimiento (lectura) 4) Cálculo de abundancia

Análisis de grupos funcionales 2- Diluciones decimales 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1- Suspensión X g suelo 9 ml H2O destilada por tubo + X ml H2O destilada 10° Agitar 3 minutos 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Recuento en medio sólido Recuento en medio líquido (Ca jas Petri) (NMP) 3- Siembra de cada grupo funcional Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores LECTURA ESTUFA 4- Incubación y crecimiento 5- Lectura y cálculos

Tapar y agitar durante tres minutos Suspensión de suelo Material de trabajo Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada Tapar y agitar durante tres minutos Suspensión de suelo

Preparación de las diluciones Flamear un porta-pipeta Extraer una pipeta estéril Extraer 1ml de la suspensión de suelo

Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos Preparación de las diluciones Poner el ml en el tubo 10-1 Mezclar y extraer 1 ml Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos

Siembra en medios específicos: Amonificadores 1 2 3 4 5 6 7 8 Diluciones: -8, -7, -6 Siembrar en medio con asparagina Incubación 28-30°C, 7días

Siembra en medios selectivos: Celulolíticos 1 2 3 4 5 6 7 8 Diluciones: -5,-4,-3 Sembrar en medio líquido con papel de filtro Incubación 28-30°C, 15 días

Siembra en medios selectivos: Fijadores 1 2 3 4 5 6 7 8 Dilución: -3 Sembrar en medio sólido sin N Incubación 28-30°C, 5 días

Siembra en medios selectivos: Nitrificadores 1 2 3 4 5 6 7 8 Dilución: -3,-2,-1 Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio Incubación 28-30°C, 21 días

Siembra de grupos funcionales Batería de grupos funcionales suspensión de suelo gradilla de diluciones gradilla de nitrificadores gradilla de celulolíticos gradilla de amonificadores caja de fijadores de N Estufa de incubación

Síntesis del análisis de grupos funcionales Recuento en medio sólido (Ca jas Petri) Recuento en medio líquido (NMP) 10° Agitar 3 minutos 9 ml H2O destilada por tubo 1 ml 10-1 10-3 10-2 10-6 10-5 10-8 10-7 10-4 Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores X g suelo X ml H2O destilada + LECTURA ESTUFA

Lectura: Amonificadores (ejemplo) Agregar reactivo Nessler El color ocre detecta presencia de amonio + + + + + - - - + 6 6 6 7 7 7 8 8 8 Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15

Lectura: Celulolíticos (ejemplo) + + + + + - - + - 3 3 3 4 4 4 5 5 5 Observar alteración del papel Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15 Tipos de alteración del papel

Lectura: Fijadores (ejemplo) (-3) Contar colonias (entre 30-300) Número de colonias (UFC) = 120

Lectura: Nitrificadores (ejemplo) Agregar SO4H2 más difenilanida El color azul detecta presencia de nitrato + + + + - + - - + 1 1 1 2 2 2 3 3 3 Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15

Tabla de Mc. Grady Nº Característico NMP 000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5 001 112 1.5 223 4.2 002 0.6 113 1.9 230 2.9 003 0.9 120 231 3.6 010 121 232 4.4 011 0.61 122 2.0 233 5.3 012 0.92 123 2.4 300 2.3 013 1.2 130 1.6 301 3.9 020 0.62 131 302 6.4 021 0.93 132 303 9.5 022 133 310 4.3 023 200 0.91 311 7.5 030 0.94 201 1.4 312 12 031 1.3 202 313 16 032 203 2.6 320 9.3 033 210 321 15 100 0.36 211 322 21 101 0.72 212 2.7 323 29 102 213 3.4 330 24 103 220 2.1 331 46 110 0.73 221 2.8 332

Cálculos Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra Nº de colonias (caja de Petri) N en 1 ml sembrado en la caja o tubo X en 10 ml del tubo de la dilución usada (la más concentrada en el NMP) Tubos (NMP) X1 en 10 ml de la dilución 10° X2 en X ml de la solución 10° (volumen de la suspensión) X2 en X g de suelo de la suspensión X en 1 g de suelo Nº de microorganismos por g de suelo

Actividades Lectura de amonificadores: reacción de nessler y manejo de la tabla de Mc.Grady Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en caja de Petri Calculo: resolver problemas de abundancia de microorganismos

Crecimiento bacteriano Crecimiento exponencial Nt = N0 2n Representación semilogaritmica aritmética Cálculos de tiempos de generación N = N0 2n Log N = log N0 + n log 2 n = log N – log N0 log 2 g = t / n N = número final de células N0 =número inicial de células n = número de generaciones g = tiempo de generación t = horas o minutos de crecimiento exponencial

Curva de crecimiento Fase de latencia Fase estacionaria Fase exponencial (logarítmica) Fase estacionaria Fase de muerte Tiempo Logaritmo del número de células

Productos microbiológicos de carácter industrial Microorganismo productor Antibióticos Penicilina Tetraciclina Penicillium chrysogenum Streptomyces griseus Bebidas alcohólicas Vinos Cervezas Saccharomyces ellipsoideus S. cerevisiae y S. caribergensis Enzimas Amilasa bacteriana Pectinasas Bacillus subtilis Aspergillus wentii, A aureus Ácidos orgánicos Ácido láctico Ácido acético (vinagre) Lactobacillus delbruckii Gluconobacter suboxidans Bioinsecticida Proteína paraesporal Bacillus thuriginensis Fertilizantes biológicos Bradyrhizobium japonicum Azospirillum spp

Cultivo continuo