TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE 1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinante con los que introducen Genes en E.coli Unión artificial de DNA de distintos orígenes

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE Ha hecho posible…. Aislamiento y secuenciación de genes y secuencias de DNA Establecimiento de genotecas y elaboración de mapas genéticos Clonación de DNA y sus posteriores aplicaciones Producción de proteínas recombinantes Modificación de genes y reintroducción en organismos: transgénicos

HERRAMIENTAS BÁSICAS NECESARIAS PARA EL CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓN DEL DNA EXTRACCIÓN DEL DNA DIGESTIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN VECTORES DE CLONACIÓN GENOTECAS IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS PCR

proteínas, polisacáridos (fenol, cloroformo): lípidos EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS DNA cromosómico, DNA plasmídico. RNA A partir de virus, bacterias, células vegetales, células animales… ETAPAS BÁSICAS 1.- Ruptura de las células - Ultrasonidos - Choque térmico - Degradación enzimática (proteinasa K) - Detergentes (SDS) 2.- Eliminación de otros componentes( lípidos, proteínas, polisacáridos) - Centrifugación - Tratamiento con proteasas - Mezcla con disolventes orgánicos y centrifugación - fenol, cloroformo y eter 3.- Precipitación con alcoholes y sales - Centrifugación , secado y resuspensión en agua Fase acuosa: ácidos nucleicos Interfase: proteínas, polisacáridos Fase orgánica (fenol, cloroformo): lípidos

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN …FINALES DE LOS 60 ¿Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la invasión de ciertos virus? El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se corta en pequeños fragmentos inactivándose Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasas que cortaban el ADN en una secuencia corta y específica

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 Reconocen secuencias palindrómicas y el ccorte es simetrico - Isoesquizomeros: existen enzimas que reconocen la misma secuencis pero con distinta forma de corte. Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae AAGCTT TTCGAA

PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS: EXTREMOS COHESIVOS EXTREMOS ROMOS

ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES (>3000) QUE SE HAN AISLADO.. NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una) ALU I – primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus Extremos romos

VECTORES DE CLONACIÓN Características generales: - Replicación autónoma - Mapa de restricción conocido: un único punto de corte - Tengan marcadores selectivos: - resistencia a antibióticos - cambios de color - De fácil recuperación TIPOS: - Plásmidos - Fago l - Cósmidos - YACs - BACs

FAGO  PLÁSMIDOS DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb Clonación de fragmentos de hasta 10 kb -ADN doble y circular -Replicación autónoma; información no vital -Pueden conferir resistencia a antibioticos -Posibilidad de integración en cromosoma principal bacteriano  EPISOMA -Tamaño variable: 1 a 500Kb FAGO  EXTREMOS COS Clonación de fragmentos de hasta 25 kb lisis bacteria ciclo lisogénico DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb infecta E. coli extremos cohesivos (COS): extremos 5’ monocatenarios (12 nucleótidos de secuencia complemenaria)

Señales de empaquetamiento Cósmidos Vectores híbridos Fago l + plásmido Sitio cos: Señales de empaquetamiento Clonación de fragmentos de hasta 45 kb

BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 300 kb Factor F de Bacterias: plásmido con replicación autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana Resistencia antibióticos YACs (Yeast Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 1000 kb

+ Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo PRIMER PASO: cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a utilizar con enzimas de restricción PLÁSMIDO GEN (otro tipo de vector) SEGUNDO PASO: LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el vector y el fragmento de DNA + MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias Procariotas: transformación, conjugación Eucariotas: Electroporacion microinyección, vectores virales, proyectiles de DNA

Fórmula de Clarke y Carbon CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA Numero de clones necesarios depende de - Tamaño del inserto - Tamaño del genoma Fórmula de Clarke y Carbon N= ln (1 - p) ln (1 - f ) N= nº de clones necesarios P= probabilidad de tener el genoma completo F= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma Ejemplo -E.coli- Tamaño: 4.300 Kb P= 0,95 1300 plásmidos 300 cósmidos 130 BACs 12 YACs

IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS PARA PODER AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS… TODOS LOS MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS Southern blotting Digestión del DNA con enzimas de restricción Separación mediante electroforesis Transferencia del los fragmentos del gel a un soporte sólido (blotting) Hibridación del DNA transferido al filtro con una sonda marcada (radiactividad, fluorescencia..) Detección de los fragmentos hibridados (dependiendo del tipo de marcaje de la sonda ) SONDA: Fragmento de DNA que hibridará por complementariedad

SOUTHERN BLOTTING 1º PASO 3º PASO 2º PASO 4º PASO 5º PASO

OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS NORTHERN BLOT Similar a Southern blot pero para identificación de secuencias de RNA SLOT/DOT BLOT. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita y se transfiere a soporte sólido HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células en cultivo

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra forma de “clonación de DNA” PCR ¿Qué es? REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO” FOTOCOPIADORA MOLECULAR Técnica que nos permite amplificar o clonar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación

+ ¿Cuáles son los fundamentos? Mg ++ EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde DNA Polimerasa 5’ 3’ dTTP dATP dGTP dCTP dNTPs + Mg ++ 3’ 5’

EXTENSION DEL CEBADOR Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar 3’ 5’ DNA polimerasa DNA Polimerasa 5’ 3’

Cebadores DNA molde DNA polimerasa ¿Qué necesitamos? Tampón de la reacción (tris,BSA, K…) Nucleotidos (dNTPs, A, C, G y T) DNA polimerasa Mg++

Programas de ordenador ELECCIÓN DE PRIMERS Programas de ordenador . Primer express PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. Primer (Stanford) Sun Sparcstations only Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page. PC-Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment. Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local mirror site at WIS). Primer3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local mirror site at WIS). .NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet

Evitar G y C en el extremo 3’ ELECCIÓN DE LOS CEBADORES Evitar G y C en el extremo 3’

DNA polimerasas Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC - DNA polimerasa I de E. Coli - Fragmento Klenow de DNA polimerasa - T4 DNA polimerasa Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC - Taq DNA polimerasa - Tth polimerasa

Ciclo 1 REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES EXTENSIÓN

“n CICLOS”: ciclo 3

“n CICLOS”: ciclo 4

“n CICLOS”: ciclo 5

Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N. La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior. Después de: - 2 ciclos tenemos 2 x 2 3 ciclos - 2 x 2 x 2 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N. Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo.

Representación gráfica de la amplificación por PCR No se puede detectar la amplificación hasta el ciclo 25 Se observa una fase lineal a partir del 25 Al final existe una fase de meseta que se representa en rojo

Esto es porque la amplificación de PCR es una reacción exponencial. Si representamos los valores en una escala logarítmica, podemos ver las diferencias en ciclos anteriores. Esto es porque la amplificación de PCR es una reacción exponencial. Existe una relación directa entre el número de copias (cantidad de DNA) y el ciclo de amplificación

MARCADORES MOLECULARES IDENTIFICACIÓN GENÉTICA Patógenos Test de paternidad Trazabilidad Diagnóstico de patologías Autentificación de productos

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. ¿CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA? Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual. Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis. Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas. Causar patologías Generar variabilidad

DETECCIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA Análisis de marcadores moleculares a nivel del DNA RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases RAPDs : Random amplified polymorphic DNA SNPs . Single nucleotide polymorphisms … Para su detección : amplificación por PCR

MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, necesita reunir una serie de características: Que sea muy polimórfico, Que esté distribuido por todo el genoma. Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación Que sea público . Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva. Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN. Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes. Que sea estable

RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Origen: mutaciones delecciones insercciones reordenaciones CARACTERÍSTICAS Detectables por PCR Bialélicos Muy abundantes Ampliamente distribuidos por el genoma Codominancia Alta reproducibilidad

Ejemplo RFLP _ + _ + CC TT CT Ampl. 199 pb 165 pb 34 pb 1 2 3 4 5 6 7 8

Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb. MICROSATÉLITES Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb.

MICROSATÉLITES - Características - Su polimorfismo radica en el número de repeticiones Herencia mendeliana codominante Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10) Se han encontrado en todas las especies conocidas Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma

Fácilmente automatizable No requiere grandes cantidades de DNA Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios micros a la vez TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115 TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227

RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA) Ventajas Se utilizan primers diseñados al azar. Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos) No es necesario el conocimiento previo de la secuencia El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad

SNPs (single nucleotide polymorphisms) Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido. A C G cerdo 1 AA cerdo 2 TT T cerdo 3 AT C/C C/T

SNPs Características Variación muy frecuente (1 cada 1000bp) Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia muy estable ( t. mutación 10-6) Fácil estandarización Posibilidad de automatización