BIOTECNOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN PASADO, PRESENTE Y FUTURO Ricardo Alberio EEA – INTA Balcarce Julio, 2012

La capacidad reproductiva de las hembras es limitada En la mayoría de las especies domésticas existen entre 300.000 y 500.000 ovocitos por ovario en el momento del nacimiento • El ciclo estral en bovinos dura 21 días • En bovinos se producirían 17,4 ovulaciones por año y si no gestara, tendría 261 ovulaciones en 15 años Sin embargo, solo producirá 6 a 10 crías en su vida

La capacidad reproductiva de la hembra bovina es infinitamente menor a su potencial Las biotécnicas reproductivas están fundamentalmente orientadas a aumentar la capacidad reproductiva de las hembras

NUEVOS CONCEPTOS SOBRE USO Y APLICACIÓN DE BIOTÉCNICAS REPRODUCTIVAS ORIGINALMENTE Herramientas en programas de mejora genética Aprovechar el potencial productivo de reproductores Reproducción asistida en humanos EN ETAPAS POSTERIORES Herramienta para mejora de sistemas productivos Conservación y recuperación de especies animales Participación en variados aspectos de salud humana Biotécnicas más armónicas con la naturaleza

EVOLUCIÓN DE LAS BIOTÉCNICAS REPRODUCTIVAS (Thibier, 2005) 1era Generación I.A. Alrededor de 130 millones de vacas inseminadas/año en el mundo y entre 3 y 4 millones de vacas/año en Argentina. Uso intensivo desde 1945 2da Generación Control del ciclo estral e IATF. A partir de la década del 70. En nuestro país, con uso explosivo a partir del siglo XXI. Actualmente cerca de 1.5 millones son IATF

3era Generación Superovulación y Transferencia de embriones. Más de 600 mil transferencias/año. En uso comercial desde 1975. En Argentina se estima aprox. 25000 colectados y 6000 transferidos/año 4ta Generación Sexado de embriones (1990) y de semen (siglo XXI), y producción in vitro de embriones (PIV) (1992), varios miles por año y crecimiento explosivo en Brasil siglo XXI 5ta Generación Clonado y transgénesis. Desarrollo y uso incrementado a partir de Dolly (fines del siglo XX)

Baja adopción de la IA en el mundo (10 a 20% de LA I.A. Y SUS DERIVACIONES (1ra y 2da generación de biotécnicas reproductivas) Baja adopción de la IA en el mundo (10 a 20% de hembras susceptibles de ser inseminadas) y cerca del 20% en nuestro país

PENETRACIÓN DE LA IA EN EL MUNDO

VENTAJAS Y APLICACIONES DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Como herramienta de los programas de mejora genética al posibilitar el aumento del progreso genético por Aumento de la eficiencia de estimación del valor genético (ensayo de progenie) Uso intensivo de machos de alto valor genético Rápida difusión de la genética superior Disminución del intervalo generacional

Control de enfermedades venéreas Eliminación de costos asociados al toro Posibilita el uso de machos incapacitados Transporte y conservación prolongada de material genético Utilización de semen sexado

Principales limitantes en el ganado para carne LA I.A. Y SUS DERIVACIONES (1ra y 2da generación de biotécnicas reproductivas) Estancamiento en la década del 90. CAUSAS?? Principales limitantes en el ganado para carne Diversidad en los caracteres a seleccionar Dificultades de la labor en los sistemas extensivos (anestro; detección de celos; manejo; baja fertilidad)

1- Se requieren al menos 40 a 50 días para que cada hembra salga del anestro y que reciba un servicio por IA 2- Solo entre el 60 a 80% de los celos son detectados por el hombre y ligeras mejoras con ayudas 3. En vacas con terneros, los factores anteriores limitan aún más la implementación de la IA (por el anestro y por la presencia del ternero) 4. En un rodeo con servicio completo por IA es casi imposible llegar a la misma preñez que con servicio con toros

Que solución se desarrolló para esto? La inducción y sincronización de los celos + IATF 48 horas COLOCACIÓN EXTRACCIÓN IATF n=100 a 600 Progestágeno Progestágeno Día 0 Día 7 u 8 Día 9 o 10 ESTRADIOL + Prog ESTRADIOL + PGF

De que forma se asocia esta biotécnica con las principales limitantes de la IA? Al inducir celo sincronizado 1- Se evita la detección de celos y permite la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) 2- Se reduce la incidencia del anestro posparto 3- Se reducen significativamente los tiempos y los recursos humanos y físicos destinados a ella 4- Se mejora la fertilidad final al haber más celos durante el período de servicio Se puede concluir así que la IATF resuelve buena parte de las limitantes del uso de la mejora genética por IA

De que forma se asocia esta biotécnica con las principales limitantes de la IA? 1- Eliminación de la necesidad de detección de celos y aplicación de la inseminación a tiempo fijo (IATF) Preñez a la IATF (%) 40-55 Preñez por IA del retorno (%) 25-30 Preñez a la IATF + retorno (%) 65-85 Total días de trabajo 8 Total días de servicio 6 Días entre primero y último servicio 25

2- La resolución del estado de anestro Por cada día que el anestro se prolonga más allá de los 60 días después del parto se pierden 833 grs de ternero por vaca entorada Habich y Joandet, 1978 En nuestro sistema pastoril el anestro dura entre 50 y 100 días. una vaca con un anestro de 90 días destetará 25 kg menos que una vaca con un anestro de 60 días

3- Impacto productivo per se CASOS Parición previa (%) 90 75 80 Distr. Paric. 60 30 10 33 34 50 20 CC 3.5 2.5 Preñez a IATF 55 Mejora en % 11 24 14 15

RESULTADO: CRECIMIENTO EXPONENCIAL EVOLUCIÓN DE LA COMERCIALIZACIÓN DE SEMEN ÚLTIMOS 8 AÑOS (en miles) AÑO LECHE CARNE TOTAL DIF 2001 1470 750 2210 2005 2260 1580 3840 73% 2008 2600 1800 4400 14% (100%)

HEMOS VISTO ASÍ QUE LOS TRATAMIENTOS QUE POSIBILITAN LA IATF PERMITEN 1- Incorporar la mejora genética 2- Acortar el anestro posparto 3- Producir más terneros y más pesados

SE DETERMINÓ UNA MEJORA DEL 20% EN KG DE TERNERO PRODUCIDO Pero esto que de por si ya es interesante, solo tiene en cuenta a las características de la IA como herramienta para la introducción de mejora genética PERFORNANCE PRODUCTIVA DE 1900 VACAS COMPARANDO IATF vs SERVICIO NATURAL SE DETERMINÓ UNA MEJORA DEL 20% EN KG DE TERNERO PRODUCIDO 59% PERFORMANCE REPRODUCTIVA (por parición más temprana) 41% GENÉTICA Adaptado de Cutaia , 2003 Δ

CONCLUSIONES DEL TEMA 1- BAJO TODOS LAS FORMAS DE ANÁLISIS, EL AGRUPAMIENTO DE LAS PARICIONES AUMENTA EL MARGEN BRUTO 2- AL AGREGAR LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL, TAL MEJORA SE POTENCIA 3- EN SITUACIONES EN QUE EL SERVICIO NATURAL DARÁ POBRES RESULTADOS, LOS TRATAMIENTOS SIEMPRE LO MEJORAN. EN ESTOS CASOS, EL MARGEN BRUTO SERÁ MEJOR QUE EN LAS BUENAS CONDICIONES

CONCLUSIÓN Hoy disponemos de una biotecnología probada que permite 4- NO SIEMPRE UN RESULTADO BIOLÓGICO POBRE ES SINÓNIMO DE MAL RESULTADO ECONÓMICO CONCLUSIÓN Hoy disponemos de una biotecnología probada que permite incorporar genética superior de forma simple, en un gran número de animales, sin restricción de categorías, eliminando la detección de celo y permitiendo por si misma un aumento de la eficiencia del rodeo

ELECCIÓN DEL SEXO DE LAS CRÍAS

Sexado de los embriones Diferentes métodos desarrollados en década del 80 Simplicidad en detección (dos hs) pero complejidad en la obtención de muestras - Limitantes sanitarias Sexado del semen Desarrollado a fines década del 80 Mejorado a niveles de utilización comercial siglo XXI Su uso en IA se desarrolla en todo el mundo Actualmente más de 5000 IA en nuestro país

RESULTADOS POSIBLES 1- MUESTRA AÚN IMPORTANTE VARIABILIDAD Entre establecimientos y entre toros Capitaine Funes, 2008

1- RESULTADOS OBTENIDOS CON IA CELO NATURAL (uso de diferentes concentraciones) Tratamiento Total IA (n) Preñadas n (%) Expto. 3 2x106, sexado 38 18 (47,3)ª 6x106, sexado 37 21 (56,7)ªb 20x106, convencional 40 29 (72,5)b Seidel y Schenk, 2008

Casos n Preñez IATF (%) Repaso Preñez repaso (%) Preñez total (%) 1 2- RESULTADOS OBTENIDOS CON IATF Casos n Preñez IATF (%) Repaso Preñez repaso (%) Preñez total (%) 1 197 35.5 96 54.2 61.9 2 185 38.9 93 31.2 54.6 Total 382 37.1 189 42.8 58.3 Cutaia y col. 2007

IATF A 67-68 HS POSTRATAMIENTO ASOCIADA CON GnRH (0,0105mg): 55% 2- RESULTADOS OBTENIDOS CON IATF (evaluación de lugar de momento de inseminación) QUIZÁS LA MEJOR ALTERNATIVA IATF A 67-68 HS POSTRATAMIENTO ASOCIADA CON GnRH (0,0105mg): 55% INSEMINACIÓN A CELO DETECTADO: 52,6% Lagioia y col. 2008

2- RESULTADOS OBTENIDOS CON IATF (evaluación del número de inseminaciones) TRATAMIENTO PREÑADAS (%) SEXADO X 1 (n 90) 35,6ª SEXADO X 2 (n 90) 40,0a SIN SEXAR (n 134) 54,5b * Números seguidos de letras distintas difieren entre sí P < 0.05

A PESAR DE LO ANTERIOR PUEDE TENER FUERTE IMPACTO PRODUCTIVO CONCLUSIONES DEL TEMA Resultados inferiores en 20-25 puntos con respecto semen convencional Poco aconsejado su uso con IATF Restringido sobre todo a vaquillonas Pocos toros de elección A PESAR DE LO ANTERIOR PUEDE TENER FUERTE IMPACTO PRODUCTIVO

ASPECTOS MEJORAR EN LA IA Y SUS DERIVADOS (IATF- SEMEN SEXADO)

1- Aumentar su difusión para que su uso tenga impacto a nivel del rodeo nacional 2- Desarrollar alternativas de manejo que prescindan de tratamientos hormonales (fotoperíodo, bioestimulación, etc) 3- Incorporar en forma más regular la utilización del semen sin congelar que permite multiplicar por 10 el rendimiento de un eyaculado y utilizar toros que congelan mal 4- Mejorar de la eficiencia en el uso del semen sexado

SUPEROVULACIÓN, PRODUCCIÓN Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (3ra y 4ta generación de biotécnicas reproductivas)

PRODUCCIÓN IN VIVO Implica la superovulación de vacas de alta genética y la transferencia de embriones supernumerarios a vacas receptoras

EVOLUCIÓN EN EL MUNDO 1980 1995 2005 2008 EEUU 10000 124000 276000 283000 EUROPA 110000 97300 89900 BRASIL 24000 107000 70000 ARGENTINA 500 9200 14000 11000 TOTAL 10500 267200 494300 453900

CRECIMIENTO EN ARGENTINA En amarillo: crías nacidas. En azul: embriones transferidos 4000 8000 12000 16000 80 84 88 92 96 OO O4 O7

SEMEN SEXADO PARA PRODUCIR EMBRIONES ESQUEMA DE IA TIPO DE SEMEN Número de inseminaciones y celo natural o IATF ESQUEMA DE IA TIPO DE SEMEN EMBRIONES TRANSFERIBLES 2 IA 12 y 24 hs post celo detectado SS 3,3 4,1 SC 8,7 1 IATF 70-72 hs post PGF 1,3 2,0 3,1

EN OTROS TRABAJOS REALIZADOS CON EL MISMO FIN, SIEMPRE SE OBSERVÓ QUE LA CANTIDAD DE EMBRIONES ERA SIGNIFICATIVAMENTE INFERIOR A LA OBTENIDA CON SEMEN CONVENCIONAL ES ACEPTADO EN GENERAL LA NO CONVENIENCIA DEL USO DEL SEMEN SEXADO EN SUPEROVULACIÓN LA DISPERSIÓN DE OVULACIONES QUE EXISTE EN UNA VACA SUPEROVULADA SERÍA EL ORIGEN DEL PROBLEMA

PRODUCCIÓN IN VITRO Implica la obtención de ovocitos, su maduración, fertilización y desarrollo en laboratorio hasta que los embriones producidos son transferidos o criopreservados Comienza a ser utilizada con fines productivos en la década del 90

En miles de embriones transferidos. Fuente IETS EVOLUCIÓN EN EL MUNDO En miles de embriones transferidos. Fuente IETS Países AÑOS 97 99 01 03 05 06 Asia 10.5 12 23 150 127 Europa 18.3 14 13 11 6.6 6 S. Am 0.056 49 80 130 N. Am 4.8 2 0.5 15 TOTAL 30.5 31.3 41 83 240 266

De donde provienen los ovocitos??

a- De animales que se envían a faena a- De animales que se envían a faena. Miles de animales de alta genética van al matadero por año y esta genética podría ser recuperada por esta técnica

b- De hembras castradas b- De hembras castradas. Por cada vaca castrada o que va a matadero (2 ovarios recuperados) se pueden obtener entre 15 a 20 óvulos, lo que permitirá obtener de 4 a 6 embriones para transferir

c- De hembras vivas. Por punción ovárica transvaginal (ultrasonografía y bomba de vacío). La cantidad de será inferior que la obtenida de ovarios de matadero o castración (5 a 10 vs 15 a 20). Pero resulta más eficiente para producir embriones que la superovulación, en un determinado período

CUANTOS EMBRIONES SE PUEDEN OBTENER DE UNA VACA?? GRAN VARIACIÓN ENTRE RAZAS 1- Indicas o cruzas: 10 a 100 2- Razas lecheras (HA): 10 a 30 3- Razas para carne bos taurus: 5 a 15 SEGÚN ORIGEN DE LOS OVOCITOS 1- Vacas de matadero o castradas: 2 a 100 según raza 2- Punción ovárica de vacas vivas: 2 a 30por sesión y Se puede repetir dos veces por semana, varias semanas

1- Recuperación de genética de vacas que han cumplido IMPACTOS PRODUCTIVOS 1- Recuperación de genética de vacas que han cumplido su ciclo y obtención de crías con genética superior Vacas ovarios Embr Embr/ Embr Vacas ovar. congel vaca transf preñadas (%) 120 237 631 5.2 228 106 (46.5) Aller et al., 2000

2- Producción de terneros de vacas vivas de alta genética en mayor cantidad que los que se obtienen por medio de la superovulación Es posible producir embriones de: Vacas que no responden a la SO Vacas preñadas hasta el 4-5 mes Terneras jóvenes

3- Maximización en el uso de una dosis de semen (25 a 30 terneros con una dosis) 4- Cambios de raza y cruzamientos con costos inferiores a los de otras modalidades 5- Creación de bancos de germoplasma, (ej. razas autóctonas), a bajo costo. 6- Producción de animales sexados por uso de semen sexado. De gran potencial pero su aplicación tiene aún limitantes importantes

Mejora de la eficiencia de la IA Producción de mellizos EMBR. RECEP. PREÑ PREÑ CON TERNEROS/ (n) (%) MELLI (%) TOTAL In Vitro 46 22 10 32 (47.8) (21.7) (69.%) Alberio y Aller, 1997 Mejora de la eficiencia de la IA Tratat N Vacas preñadas (%) Terneros producidos (%) IATF+ TE 29 51.7a 17 (58.6)a IATF 132 30.3b 40 (30.3)b IATF a 72 hs después de doble PGF2 alfa. a dif. de b (P<0.01). Alberio y col. 1997

ASPECTOS A MEJORAR Tasa de producción y calidad de embriones Metodología de vitrificación de embriones Producción de embriones con semen sexado Producción de embriones cuando los ovocitos son obtenidos a partir de vacas vivas

5ta generación de biotécnicas reproductivas LA CLONACIÓN Y LA TRANSGÉNESIS 5ta generación de biotécnicas reproductivas CLONACIÓN Producción de copias idénticas de forma asexual de un organismo ya desarrollado TRANSGÉNESIS Alteración de la información genómica con la intención de modificar en forma específica una característica física de un animal (Brink et al., 2000)

INTERES DE APLICACIÓN 1- Producción de individuos idénticos ya sea de gran interés genético productivo o afectivo. Reciente demostración por la FDA de la inocuidad de carne o leche proveniente de animales clones 2- Recuperación de especies en vías de extinción e incluso de especies desaparecidas

3- Disponer de biorreactores animales capaces de producir proteínas tanto de interés médico (factores de coagulación sanguínea, la hormona de crecimiento, insulina, etc) como industrial (producción de proteína polimerizante, quimosina, etc) y generación de modelos animales para el estudio de enfermedades humanas (fibrosis quística, esclerosis múltiple, enfermedad de priones) 4- Posiblidad de producir tejidos humanos que podrían servir como reemplazos en casos de necesidad de ello o tejidos producidos en animales transgénicos que no produzcan fenómeno de rechazo (xenotrasplante)

CUANDO SE PRODUCE EL CAMBIO FUNDAMENTAL?? El año 1997 y la oveja DOLLY marcan conceptos biológicos nuevos que abren el camino actual ya que posibilitó la clonación verdadera

SITUACIÓN EN ARGENTINA Primeros clones bovinos producidos en el país por medio de la partición mecánica de embriones obtenidos in vivo (1991)

Desarrollo de la técnica de clonación por transferencia nuclear, logrando las primeras gestaciones con los embriones así producidos (2002).

PRIMERA TERNERA CLONADA NACIDA EN ARGENTINA (PAMPA- 2002) VACA TRANSGÉNICA. PRODUCE EN SU LECHE HORMONA DE CRECIMIENTO (PAMPA MANSA -2002 TERNERA CAPAZ DE PRODUCIR EN SU LECHE INSULINA HUMANA (PATAGONIA I- 2007)

PRIMERA VACA DOBLE TRANSGÉNICA PRODUCE EN SU LECHE DOS PROTEINAS DE LA LECHE HUMANA: LACTOFERRINA Y LIZOSIMA B 1 DÍA (42 kg) 15 MESES (380 kg) UN MES (55 kg) INTA BALCARCE. 2011

ASPECTOS A MEJORAR Eficiencia, aún extremadamente baja (2 a 4% de éxitos) Disminución de los costos de producción Derivación de células somáticas a células madre Mejora del sistema de introducción de genes a los ovocitos

CONCLUSIONES GENERALES 1- Se ha consolidado una tecnología ya desarrollada y se han encontrado nuevos motivos de aplicación: IA 2- Se ha incorporado de forma explosiva una nueva tecnología con una nueva potencialidad en el área de producción animal: IATF

CONCLUSIONES GENERALES 3- Se han desarrollado tecnologías vinculadas a la multiplicación de hembras de alto valor genético y a la recuperación de genética que va al digestor: SOTE y PIV de embriones 4- Se han desarrollado técnicas de avanzada que van a significar cambios fundamentales en la productividad de los animales domésticos: SEXADO DE SEMEN, CLONADO y TRANSGÉNESIS