Transformación Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Transformación Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

pGLO™ & GFP

Dogma Central de la Biología Molecular ADN ARN Proteína Característica

Conexiones con el mundo real GFP es un marcador visual Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas) Localización y regulación de la expresión de un gen Movimiento celular El destino celular durante el desarrollo Formación de los diferentes órganos Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

Scientists use GFP as a Tracer Proteínas Híbridas Fluorescentes

Procedimiento de Transformación Day 1 Day 2

Temas Cubiertos Introducción Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

Kit de Transformación de Bacteria con plásmido pGLO™

¿Qué es una Transformación? Alteracion de una Bacteria como resultado de la incorporación de ADN exógeno (que viene de afuera de la célula). Frecuentemente, el ADN es circular y llamado plásmido. GFP bacteria b-Lactamasa Confiere Resistencia al Antibiótico Ampicilina. plásmidos

¿Qué es un plásmido? Un pedazo circular de ADN de doble cadena, que se replica autónomamente. Fue evolucionado originalmente en bacterias. Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés.

Las diferentes caras de un plásmido Micrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica

Plásmido pGLO Beta-Lactamasa Confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Proteína Verde Fluorescente (“Green Fluorescent Protein, GFP”) Aequorea victoria, gen de medusa araC: Regulador Regula la transcripción de GFP

Transformación con pGLO Pared celular GFP Bacteria Cromosoma Bacteriano (ADN) Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO

ADN Bacteriano Célula de Bacteria Plásmido de ADN ADN Geonómico

Regulación de Transcripción Operón de lactosa Operón de Arabinosa Plásmidos de pGLO

Regulación de Transcripción Operón lac Operón ara LacI araC B A D Z Y A Efector (Arabinosa) Efector (Lactosa) araC B A D LacI Z Y A ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC Z Y A araC B A D

Regulación de la expresión del gen Operón ara Operón GFP araC B A D araC Gen de GFP Efector (Arabinosa) Efector (Arabinosa) araC B A D araC Gen de GFP ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC araC B A D araC araC Gen de GFP

Métodos de Transformación Electroporación Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN Cloruro de Calcio y Choque Térmico Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico

Proceso de Transformacion Suspender las colonias en la Solución de Transformación. Añadir el plásmido pGLO ADN. Incubar los tubos en hielo por 10 minutos. Choque térmico a 42°C por exactamente 50 segundos, y luego colocar en hielo por 2 minutos. Añadir el caldo nutriente LB e incubar a temperatura ambiente. Esparcir 100 mL de la suspensión por la superficie de las placas de agar.

¿Que es el caldo nutriente de LB? Caldo Luria-Bertani (LB) Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés. carbohidratos aminoácidos nucleótidos sales vitaminas

Medida de Volumen en los Goteros Plásticas

Importancia de cada paso de la transformación Base O O CH2 La solución de transformación contiene CaCI2 . La carga positiva del los iones de Ca2+ neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN. Azúcar O Ca++ O P O Base O O CH2 Azúcar OH

Importancia de cada paso de la transformación Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular. 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular. 4. La recuperación con LB permite la expresión de la beta-lactamasa. Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina)

¿Crecer? ¿Brillar? Siga el protocolo ¿En qué placas crecerán colonias? ¿Qué colonias brillarán? LB/Amp LB/Amp/Ara LB

¿Qué observó en las placas de agar? Crecimiento de colonias que no brillan. Crecimiento de colonias que sí brillan. Ningún Crecimiento de Bacterias. Crecimiento en área completa.