Coloraciones Dr. Martín Fernández Baldo Laboratorio de Parasitología y Micología Área de Análisis Clínicos Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS

COLORANTES CLASIFICACIÓN COLORANTES NATURALES (azafrán) COLORANTES ARTIFICIALES Básicos : tiñen estructuras ácidas AZUL DE METILENO Ácidos: tiñen estructuras básicas EOSINA Neutros: el ácido y la base son componentes activos EOSINATO AZUL DE METILENO

Métodos de Coloración Clasificación Según tiñan de manera difusa o selectiva: Difusas (no en microscopía) Específicas: colorea solo un elemento o un grupo de elementos de un tejido. directas (simple inmersión del colorante) indirectas (no puede obrar directamente) sustancias oxidantes mordientes mordiente + colorante = LACA

Métodos de Coloración Clasificación De acuerdo a la manera de realizar la coloración: Progresivas (aumentan la intensidad de la coloración a medida que aumenta el tiempo de exposición al colorante) Regresivas (sobrecolorean el preparado, decolorándolo para conseguir contraste adecuado). Según utilicen uno o varios colorantes: Simples (un solo colorante) Combinadas (varios)

Métodos de Coloración Clasificación En coloraciones simples según tomen o no el mismo color del colorante pueden ser: Normocromáticas (mismo color) Metacromáticas (viran hacia un tono distinto). Granulaciones de leucocitos COLORACIONES PANÓPTICAS (poner en evidencia el mayor número de elementos con mayor variedad de tonos) colorantes neutros o anfocromos - metacromasia COLORACIONES VITALES colorantes vitales no tóxicos muy diluidos LUGOL, EOSINA, AZUL DE METILENO (ideal para protozoarios).

FIJACION Operación destinada a matar la célula, conservándola tanto como sea posible, en el mismo estado en que se encontraba. FÍSICOS Calor QUÍMICOS Acetona, etanol, APV FÍSICO-QUÍMICOS Calor + etanol

TP de Laboratorio Muestras de sangre Gota Gruesa Extendidos de sangre Coloración de May–Grünwald-Giemsa Giemsa Coloración Vital: Lugol Observación Microscópica

GOTA GRUESA (para recordar) Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. (hemólisis-coloración) Lavar y secar 1-2min Dejar secar Desfibrinar Colocar 1 a 3 gotas objetivo de 100x aceite Tripanosoma cruzi Sensibilidad 50%

Coloración de May Grünwald-Giemsa Empleo dos soluciones colorantes: La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol. La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidación de este último tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo. Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se mantienen en metanol, pero al añadir agua se ionizan y se unen selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles. Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son llamados basófilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en ARN). Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos eosinófilos.

Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta. Resultado: Los núcleos aparecen en colores que van del color azul al púrpura-negro. Los citoplasmas de las células maduras aparecen de un color violeta muy pálido o marrón muy pálido. Los glóbulos rojos, ricos en hemoglobina aparecen de colores entre rosados y beige. Los gránulos de los neutrófilos aparecen de colores entre violeta y marrón. Los gránulos de los eosinófilos aparecen de color naranja. Los gránulos de los basófilos de color entre azul y negro. Los gránulos de los linfocitos grandes aparecen de color púrpura. Las células con gran producción de ARN (como linfocitos productores de inmunoglobulinas y células inmaduras) presentan un citoplasma de color azul intenso. Parásitos: citoplasma azul-celeste y sustancias cromáticas color violeta.

Fijación El primer paso es fijar las células sanguíneas presentes en el frotis. La fijación es un proceso fisicoquímico que altera las propiedades químicas de las proteínas que forman las células, para que luego resistan el proceso de teñido preservando la estructura que tenían cuando estaban vivas. La fijación la hace el metanol de la solución de May-Grünwald (colorante neutro disuelto en metanol: carece de propiedades tintoriales). Para fijar se colocan los frotis horizontalmente en una parrilla y se vierten 20 gotas de solución sobre cada uno hasta que los frotis queden completamente cubiertos. Se mantienen así durante 3 minutos para que el metanol fije las células. Tinción con May-Grünwald Simultáneamente al proceso de fijación, tanto el azul de metileno como la eosina habrán llegado a todos los compartimientos celulares, pero los colorantes no se podrán unir a sus respectivas estructuras afines hasta que la solución se convierta en polar, esto se consigue agregando lentamente agua (de la canilla, igual volumen sin volcar el colorante), permitiendo así que los colorantes precipiten selectivamente. Dejar 1 minuto. Lavado y rehidratación - Tinción con Giemsa La solución de Giemsa (se prepara en el momento) es mucho más polar que la solución de May-Grünwald. Volcar y sin lavar recubrir con solución de Giemsa (1 gota de colorante por cada ml de agua). 15-30 minutos. Se lavan los portaobjetos con agua y se dejan escurrir en posición vertical hasta que estén completamente secos.

Observación Se hace en microscopio óptico de gran aumento con objetivo de inmersión en aceite, esto permite ver detalles de la cromatina de los núcleos y dilucidar correctamente las estructuras observadas.

Cuáles son los parásitos que se pueden ver en un extendido de sangre coloreado?

Gracias por la atención…