Fundamentos de microscopía óptica Curso 2013 Aplicación de la microscopía en el diagnóstico clínico Diego Fernando Lopez Muñoz 13/02/2013

Fundamentos de microscopía óptica Contenidos 1. Introducción 2. Objetivo de inmersión 3. Microbiología 3.1. Coloración de Gram 3.2. Coloración de Zielh-Neelsen 3.3. Microscopía de fluorescencia 3.4. Microscopía de campo oscuro 4. Hematología 4.1. Coloración de Wright 4.2. Coloración de gota gruesa Fundamentos de microscopía óptica [2]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Menos costosa Límite resolución (200nm) Luz visible Células vivas, fijadas y teñidas Objetivos 4x, 10x, 40x, 100x Microscopía óptica Campo luminoso Campo oscuro La microscopía óptica es una de las herramientas mas utilizadas en el laboratorio clínico como soporte diagnostico en las aéreas de la microbiología y la hematología. Los mas utilizados de rutina en el laboratorio son: Campo luminoso: para observar preparaciones teñidas y frescas. Campo oscuro: para observar microorganismos que no son detectables por el luz (bacterias del genero espiroqueta). Fluorescencia: para corroborar ciertos diagnósticos clínicos con marcajes de fluorescencia (especialmente bacterias del genero mycobacterium). Fluorescencia Fundamentos de microscopía óptica [3]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Objetivo de inmersión 100x Hace pleno uso de la apertura numérica consiguiendo mayor resolución Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotónico. El medio de inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal. Fundamentos de microscopía óptica [4]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Objetivo de inmersión 100x La gota de aceite de inmersión se situa entre el obejetivo y la muestra. Fundamentos de microscopía óptica [5]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Gram Permite conocer la morfología celular bacteriana Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram Positivas Tiene utilidad diagnostica la coloración en muestras de orina, líquidos corporales, sangre, hisopados faríngeos y nasofaríngeos, frotis vaginales y uretrales, abscesos, tejidos y exudados también puede aplicarse al uso de material hospitalario como catéteres y soluciones para el diagnostico y control de las enfermedades nosocomiales. Fundamentos de microscopía óptica [6]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Gram En función del color podemos conocer: Forma Agrupación Tamaño En función de la tinción que adquieran las muestras biológicas podremos encontrar características como la forma (cocos, bacilos, cocobacilos, bacilos y espirilos), agrupación (parejas, racimos, cadenas y empalizadas), y tamaño de las células bacterianas a partir tanto de muestras clínicas como de cultivos bacterianos. Un buen análisis en la coloración de Gram orienta al clínico a determinar conductas de tratamiento en caso de infección, además orienta de acuerdo a la interpretación de la coloración a seguir un tratamiento de elección de antibióticos. Diagnóstico Fundamentos de microscopía óptica [7]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Zielh-Neelsen Pared celular de las micobacterias 1 Lípidos externos 2 Ácido micólico 3 Polisacáridos (arabinogalactano) 4 Peptidoglicano 5 Membrana plasmática 6 Lipoarabinomanano (LAM) 7 Fosfatidilinositol manosido. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Zielh, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo. La acido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fucsina fenicada (de color fucsia) o auramina (amarillo fluorescente) y retenerla aún con la acción de decolorantes, como la mezcla de acido y alcohol. Esta característica se debe al alto contenido en lípidos, particularmente a los ácidos micólicos, que poseen en la pared celular. Fundamentos de microscopía óptica [8]

Observación de mycobacterium a 100x Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Zielh-Neelsen Observación de mycobacterium a 100x Con la coloración de Ziehl-Neelsen, se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. En los extendidos teñidos con auramina los bastoncillos se observan con fluorescencia amarilla. El examen microscópico solo orienta el Diagnostico Clínico dependiendo del espécimen analizado, lo anterior debe estar corroborado con un cultivo del microorganismo y otras ayudas diagnosticas. Fundamentos de microscopía óptica [9]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Microscopía de fluorescencia Epifluorescencia Fluorocromo La fluorescencia es la capacidad que tienen algunas sustancias de emitir luz en una longitud de onda determinada, bien en forma espontanea (natural) o bien inducida, cuando se excita mediante una onda electromagnética de longitud de onda característica. El microscopio de fluorescencia aprovecha esta propiedad de las sustancias al poder manejar mediante filtros la longitud de onda que incide y que emite una muestra determinada. Actualmente el microscopio de fluorescencia más utilizado es el de epifluorescencia, que simplemente indica que la luz filtrada no atraviesa la muestra sino que incide sobre ella a través de la lente objetivo, y esta misma lente es la encargada de recoger la luz que emite la muestra excitada. Generalmente, en microscopia de fluorescencia la muestra es tratada con marcadores fluorescentes, basados en fluorocromos (sustancias capaces de emitir luz en una longitud de onda determinada), de tal forma que se puede controlar el tipo de fluorescencia que se quiere observar y relacionarla con la muestra marcada. Muestra Fundamentos de microscopía óptica [10]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Microscopía de fluorescencia Epifluorescencia Este microscopio muestra un buen rendimiento a la hora de diagnosticar micobacterias en muestras biológicas, ya sea esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, lavados bronquiales y gástricos, orina y sangre de hemocultivos positivos Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos de auramina – rodamina. Estos se fijan a la pared de las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra fondo verdoso. El permanganato potásico, empleado como contraste evita la fluorescencia inespecífica. Un aspecto importante de esta coloración es que los frotis pueden ser teñidos con la coloración de Z-N directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. Diagnóstico de micobacterias Tinción con auramina Fundamentos de microscopía óptica [11]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Microscopía de campo oscuro Bloquea los rayos centrales que alcanza al condensador logrando que el fondo aparezca negro y los especímenes brillantes. La lente del objetivo no capta la luz directa proveniente de la fuente luminosa. Un condensador específico permite transmitir la luz de forma circular dejando el centro oscuro. Con esto se logra que el fondo de la muestra aparezca negro y los especímenes (bacterias en este caso), brillantes. Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo. Hace posible la observación del movimiento browniano de las partículas. Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear. Utilidad: en la práctica clínica para la detección e identificación de bacterias del género espiroqueta, entre las más representativas tenemos el Treponema pallidium y la leptospira. Detección de espiroquetas (Treponema pallidium o leptospira) Fundamentos de microscopía óptica [12]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Microscopía de campo oscuro Treponema pallidum Causante de sífilis Leptospira Causante de Leptospirosis Sífilis definición y etiología El agente causal de la sífilis pertenece a un grupo de bacterias conocido como Treponemataceae, el cual agrupa tres géneros de bacterias Leptospira, Borrelia y Treponema. Todos ellos se caracterizan por tener una pared celular flexible. El agente causal de la sífilis pertenece al género Treponema, y es denominado como Treponema pallidum. En un principio la enfermedad era mortal y aguda, mataba en pocos días. Hoy la enfermedad se define como una enfermedad de transmisión sexual, de evolución crónica o lenta, que ataca prácticamente todos los órganos del cuerpo humano, producida específicamente por Treponema pallidum. La sífilis junto con la tuberculosis son consideradas como las grandes simuladoras, ya que ellas simulan cualquier tipo de enfermedad o pueden ser confundidas por los médicos con cualquier tipo de enfermedad. Leptospirosis Es una zoonosis de distribución mundial, producida por una espiroqueta de las cepas patógenas del genero Leptospira, que afecta tanto a los animales silvestres y domésticos así como al hombre, se caracteriza por fiebre, mialgias procesos hemorrágicos, ictericia, nefritis, hemoglobinuria, anorexia, nauseas, cefalea, etc. El término “leptospira” procede del griego lepto (fino) y Spira (espiral). Las Leptospiras son espiroquetas aerobias obligadas, flexibles, muy finas, helicoidalmente enrollada en S, y de gran movilidad, de 5 a 20 um. De largo por 0,1 a 0,5 um de ancho. Las leptospiras solo pueden ser visibles por microscopia de campo oscuro o de contraste de fase, pero no por microscopia de luz brillante. No se tiñen con facilidad con los colorantes aunque son Gram negativas. Fundamentos de microscopía óptica [13]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Wright Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades. Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para contar glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones. Tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre Muy sensible a las variaciones de pH Fundamentos de microscopía óptica [14]

Tinción tipo Romanowsky Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Wright Tinción tipo Romanowsky (Eosina y azul de metileno) Núcleos de leucocitos y neutrófilos Eritrocitos El efecto Romanowsky da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. En la mayoría de los laboratorios los colorantes más empleados para la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky constituido fundamentalmente con la mezcla de eosina (ácido) y azul de metileno (básico). Fundamentos de microscopía óptica [15]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de gota gruesa Utilizada para diagnóstico de malaria Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensión en capa fina. Para gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos rápidos, extendiéndose en una capa gruesa y uniforme. La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad de sangre, facilitando la detección de parasitemias bajas y un ahorro de tiempo en el examen, aunque al romperse los eritrocitos resulta difícil la identificación de la especie. Pueden parasitar al hombre: Plasmodium falciparum, vivax, ovale y malarie. Fundamentos de microscopía óptica [16]

Coloración de gota gruesa Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de gota gruesa Tinción GIEMSA La tinción de Giemsa: es la técnica diagnostica de referencia. Este colorante sirve tanto para la gota gruesa como para el frotis. La técnica está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul Gameto de plasmodium vivax Formas anulares de plasmodium falciparum Fundamentos de microscopía óptica y electrónica [17]

Fundamentos de microscopía óptica Introducción Objetivo de inmersión Microbiología Hematología Coloración de Wright Diagnóstico de anemias La coloración de gota gruesa es utilizada también para diagnosticar anemias. Anemia megaloblástica Anemia drepanocítica Fundamentos de microscopía óptica [18]

Fundamentos de microscopía óptica Gracias por su atención Fundamentos de microscopía óptica [19]