p53, ALTERACIONES CROMOSOMICAS, TABAQUISMO Y ARSÉNICO EN CÁNCER DE VEJIGA

Rey, Omar Sambuelli Ruben Guidi, Andrés Gómez Silvia Moore, Lee Smith, Allan

Introducción: Estudios previos demostraron que tabaquismo y exposición al arsénico en el agua de beber son factores de riesgo para cáncer de vejiga.

La exposición al arsénico inorgánico como agente cancerígeno está demostrada en varios cánceres humanos, incluído el urotelial vesical y es un grave problema de salud pública.

El mecanismo y dosis a los cuales el As provoca cáncer no está bien claro.

No hay datos que comparen genéticamente los cánceres relacionados con el arsénico respecto a los no relacionados. Estudios genéticos comparando tumores de individuos expuestos y no expuestos al As pueden proveer datos sobre el mecanismo de estos cánceres inducidos químicamente.

La MUTACION DEL GEN de p53 se cree que es un mecanismo clave de la inactivación genética.

p53 está frecuentemente mutada en casi todos los tipos de cánceres humanos.

La inactivación del gen supresor tumoral p53 se observa en muchos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de vejiga.

El estudio fue dirigido a comparar las mutaciones de p53 en tumores vesicales en pacientes de una zona de hidroarsenicismo crónico regional endémico (HACRE).

p53 es excelente biomarcador para estudio de prevalencia, tipo y localización de mutaciones en tumores.

La proteína normal p53 actúa en la regulación del ciclo celular, mantención de la estabilidad genómica y en la apoptosis.

Mayoría de las mutaciones inactivantes de p53 consisten en mutaciones puntuales en dominios que llevan a cambios en la composición de los aminoácidos de la proteína p53.

El estudio de los patrones de cambios moleculares en el gen p53 en tejidos de tumores puede proveer claves para conocer el mecanismo de formación tumoral y de los eventos carcinogénicos iniciales.

Tipos específicos de canceres están asociados con mutaciones características.

Hay algunas evidencias de un espectro mutacional específico de p53 asociado a exposiciones a determinados carcinógenos.

Mecanismos mutacionales endógenos y exógenos pueden mostrar distintos patrones mutacionales de p53.

Mutación en sitios CpG indican compromiso de diversos agentes exógenos. Se han sugerido como loci frecuentes de daño del ADN por agentes carcinógenos exógenos las bases de citosina en sitios metilados CpG.

Carcinógenos como tabaquismo y cloruro de vinilo causan primariamente transversiones G:C a C:G, y A:T a T: A respectivamente.

El gen p53 se halla mutado en casi 40% de tumores vesicales.

Con IHQ pueden detectarse mutaciones de p53 ya que una p53 mutada posee mayor vida media detectable con el Ac.

Errores potenciales de la IHQ : puede haber mutaciones fuera de los exones examinados con sitios promotores extragénicos que llevan a expresión génica reducida o pueden resultar en codones de paro que interrumpen la traslación.

P53 también puede ser transcripcionalmente sub o sobre-expresada determinado falsa negatividad o positividad con la IHQ.

18% de las mutaciones- inserciones y delecciones- halladas en tumores vesicales resultan de un cambio G:C a A:T en el sitio de los dinucleótidos CpG Las mutaciones en sitios CpG son vía deaminación de 5´metilcitosina a timidina.

Material y métodos Se compararon tumores de vejiga de 105 pacientes fumadores y no fumadores expuestos a diversos niveles de As en el agua de beber en una zona de HACRE agrupándolos en 4 categorías basadas en la concentración media de As en el agua de beber conforme registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico de cáncer vesical

Material y métodos Exposición al As: midiendo concentración de As en agua en casa del paciente y residencias previas basándose en registros oficiales en los 5 años con mayor concentración de As- basados en registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico del Carcinoma urotelial- En caso de pozos privados se investigó el actual y anteriores, y en caso de cerrado el más próximo a similar profundidad.

G1 (0 a < 10 μg/L) G2 (10-99 μg/L), G3 (100- 299 μg/L), Material y métodos G1 (0 a < 10 μg/L) G2 (10-99 μg/L), G3 (100- 299 μg/L), G4 (> 300 μg/L).

Material y métodos Las alteraciones de p53 se estudiaron con IHQ y métodos de secuenciación para estudio de mutaciones. Se confrontaron las mutaciones de p53 con el estadio, grado, género e historia o no de tabaquismo.

Material y métodos Casos nuevos diagnósticados de Ca vesical a células transcicionales entre 1996 y 2000 en pacientes residentes en departamentos Unión y Marcos Juarez de Córdoba (población 193000 hab)- Area seleccionada por alta concentración de As en el agua y alta mortalidad por Cancer vesical

Material y métodos En pacientes se chequeo tiempo de residencia, hábitos actuales y pasados de consumo de aguas, hábitos tabáquicos si los había, e historia ocupacional.

4 grupos Material y métodos estadio y grado conforme OMS Cada grupo estratificado por estadio y grado conforme OMS género y hábito tabáquico

Material y métodos Microdisección de cortes de parafina de 5 μm, seleccionado el área de tejido menos “contaminada” con células normales no tumorales y representativa de la lesión. Tamaño mínimo requerido: 0.3 mm2 (aprox. 500 céls) Aislamiento del ADN y amplificación por PCR

Material y métodos IHQ con Ac para p53 – con recuperacion antigénica. Interpretación positiva: patrón de tinción finamente granular sólo nuclear. Estimación del número de células positivas y negativas.

Material y métodos Se consideró negativa : ninguna célula teñida. Se consideró como ”< 10%”: entre 1 célula y menos del 10% de células marcadas. Se consideraron positivas marcaciones de al menos 10% de las células.

Material y métodos Secuenciación: en la secuenciación fluorescente se usó BigDye TM de PE Biosystems, luego se purificó con kitt de Amersham Pharmacia Biotech para remover exceso de primers y nucleótidos. Primero se secuenciaron los exones en sentido “forward”- Si se sospechaba una mutación se secuenciaba para confirmar en sentido reverso con reacción de PCR independiente.

Material y métodos Se investigó también frecuencia y tipo de cambios cromosómicos comparando ADN extraído de tumores vesicales de pacientes expuestos y no expuestos al As

Material y métodos Para definir aberraciones genéticas del genoma: Técnicas de hibridación genómica comparativa (HGC) sobre ADN extraído de muestras de tumores incluidos en parafina En la HGC, las copias anormales de ADN se detectan por hibridizaciones simultáneas del tumor y ADN de metafases normales.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Test del chi- cuadrado X2 sobre tablas de análisis de contingencia para verificar variaciones en mutación y frecuencia de tinción para cada categoría de variables (género, hábito tabáquico y arsenicismo) La proporción de casos con mutaciones o IHQ positiva se calculó dividiendo el número de casos anormales totales por el número de tumores en el grupo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Con software Stata 6.0 se calculó OR e intervalos de confidencia (CI 95%). Cálculo de transciciones y transversiones dividiendo el número de tumores con una mutación dada por el número total de tumores con mutaciones

GRUPOS ESTADIO Nº % TOTAL 105 (100) Ta 31(30) T1 40(38) T2-T4 34(32)

GRUPOS GRADO Nº % TOTAL 105 (100) 1 31(30) 2 51(49) 3 21(22)

GRUPOS GENERO( p< 0.01) Masculino 90 (86%) Femenino 15 (14 %)

HABITO TABAQUICO Total Nº % Siempre 84 (80) Nunca 21 (20)

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR ESTADIO TOTAL CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS ESTADIO Ta 5.1 + 6.1 2.4 + 3.5 2.7+ 3.1 T1 5.6 + 4.9 2.4 + 2.7 3.2 + 2.7 T2-T4 9.8+ 6-3 4.8 + 3.5 5.3+3.4 p (tend) <0.001 <0.001 <0.001

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GRADO GRADO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 1 2.6+2.6 0.8+1.2 1.8+1.7 2 7.9+6.2 3.5+3.4 4.4+3.3 3 9.5+6.4 4.9+3.5 4.6+3.4 p (tend) <0.001 < 0.001 <0.001

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GENERO GENERO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS Masculino 6.7+6.1 3.0+3.3 3.7+3.1 Femenino 6.6+6.4 2.9+3.3 3.2+ 3.3 p 0.89 0.84 0.91

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR HABITO TABAQUICO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS HABITO TABAQUICO Siempre 6.9+6.0 3.1+3.3 3.8+3.1 Nunca 6.1+6.4 2.9+3.3 3.2+3.3 p 0.51 0.73 0.37

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION EXPOS. CAMBIOS GANANC. PERDID. m+ Ds m + DS m+ DS 1 5.7+5.1 2.4+2.7 3.3+2.9 2 5.6+5.1 2.4+2.9 3.3+2.8 3 7.3+7.4 3.8+4.1 3.6+3.4 4 9.1+6.5 4.1+4.0 5.1+3.4 p 0.03 0.03 0.06 p 0.02 0.008 0.05 (tend.ajust.grado y estadio)

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Exposición Bajo grado(1) 1 2 3 4 p cambios cambios cambios cambios Ta 3.3+4.9 1.2+1.1 3.3+3.3 3.0+3.6 0.67 T1 3.6+2.5 0.7+1.2 2.1+2.1 2.0 0.42 T2-4 0 2.0 0 7.0 - Total 3.5+3.1 1.1+1.1 2.5+2.5 3.6+3.2 0.79

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Exposición Alto grado(2-3) 1 2 3 4 p cambios cambios cambios cambios Ta 3.6+3.5 9.0+2.7 9.3+11.9 13.3+11 0.07 T1 7.0+5.1 6.6+5.0 5.7+3.6 9.7+6.3 0.42 T2-4 7.6+6.4 9.8+5.4 14.3+6.5 10.1+5.5 0.11 Total 6.3+5.5 8.3+4.7 10.3+7.8 10.5+6.4 0.01

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO Categoria de FUMADORES Exposición CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 1 6.3+5.3 3.7+2.8 3.6+3.0 2 5.7+5.2 2.4+3.0 3.3+2.8 3 7.1+7.1 3.6+4.1 3.5+3.2 4 9.9+ 6.0 4.3+3.2 5.7+3.2 p 0.11 0.16 0.10 p ajustada 0.03 0.02 0.06

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO Categoria de NO FUMADORES Exposición CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 1 3.8+4.1 1.6+2.1 2.4+2.3 2 5.3+5.3 2.5+2.6 2.8+2.8 3 8.9+9.8 4.8+4.7 4.0+5.4 4 7.9+7.3 3.8+5.8 4.1+3.7 p 0.08 0.04 0.25 p ajustada 0.15 0.07 0.52

El porcentaje de mutaciones halladas fue más alto en fumadores que en no fumadores y sólo en los fumadores se hallaron los pocos tumores con mutaciones dobles.

La relación con el tabaquismo fue débil, 38% de mutaciones de p53 en fumadores y 27% en no fumadores (p=0.34)

GANANCIAS p 3q (p>0.1) 0.01 ------ 0.04 (p.aj-0.03) TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO GANANCIAS p 3q (p>0.1) 0.01 ------ 0.04 (p.aj-0.03) 5p 0.04 0.003 ------- ----- 6p 0.03 0.002 ------- ----- 7p ----- 0.04 ------ ----- 10p ----- 0.01 ------ ----- 8q 0.03 ----- 0.03 ----- 11q 0.006 0.02 ----- 0.04(0.03) 17q 0.004 0.006 ----- ----- 19q ------ 0.05 ----- ----- 20q ------ 0.03 ------ -----

PERDIDAS 8p 0.0001 0.001 0.03 0.07 (0.05) 11p ------ ---- 0.06 ----- TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO PERDIDAS 8p 0.0001 0.001 0.03 0.07 (0.05) 11p ------ ---- 0.06 ----- 17p 0.0001 0.00001 5q 0.002 ----- ----- ----- 9q ------ ---- 0.04 0.03(0.03) 18q 0.03 0.05 0.08 ------ Y 0.03 ------ ------ -----

Los tipos más frecuentes de mutaciones fueron sustituciones de una sola base (transciciones y transversiones)

El porcentaje de tumores conteniendo transiciones aumentó con el estadio tumoral (tend p= 0.005) y el grado (p= 0.004), pero no fue evidente con las pocas transversiones halladas.

TRANSICIONES TRANSVERSIONES TOTAL 81% 19% ESTADIO Ta 62% 38% T1 85% 15% T2-4 84% 16% p tendencia 0.29

TRANSICIONES TRANSVERSIONES TOTAL 81% 19% GRADO 1 75% 25% 2 83% 17% 3 80% 20% p tendencia 0.99

TRANSICIONES TRANSVERSIONES TOTAL 81% 19% TABACO Siempre 85% 15% Nunca 57% 43% p tendencia 0.08

TRANSICIONES G a A en sitios CpG (a) (b) (c) TOTAL 24.6% 14.2% 40% GRADO 1 10.7% 10.7% 75% 2 24.6% 13.9% 37.5% 3 36.4% 18.2% 35.2% Tend. p 0.02 0.40 0.28 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios CpG (c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG (a) (b) (c) TOTAL 24.6% 14.2% 40% ESTADIO Ta 11.4% 11.45% 50% T1 27.5% 13.7% 41.2% T2-4 32.5% 17.5% 35% Tend. p 0.04 0.45 0.46 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios CpG (c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG (a) (b) (c) TOTAL 24.6% 14.2% 40% TABACO Siempre 28.0% 17.0% 44.7% Nunca 11.5% 3.8% 14.3% Tend. p 0.08 0.11 0.16 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios CpG (c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG (a) (b) (c) TOTAL 24.6% 14.2% 40% ARSENICO 1 16.3% 14.0% 50.0% 2 25.0% 14.3% 40.0% 3 42.9% 25.0% 53.3% 4 16.0% 0.0% 0.0% Tend. p 0.26 0.39 0.22 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios CpG (c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

ARSENICO EN NO FUMADORES SOLAMENTE (a) (b) (c) 1 20.6% 17.6% 54.5% 2 29.2% 16.7% 40.0% 3 48.0% 24.0% 70.0% 4 17.7% 0.0% 0.0% Tend. p 0.45 0.40 0.20 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios CpG (c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

La prevalencia de tumores con mutaciones transcicionales aumentó con el grado y el estadio, siendo mayor en fumadores. Se halló el codón 273 con mutación en el 11% de tumores de fumadores.

MUTACIONES DE p53 e IHQ y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO IHQ p53+ CASOS % OR OR ajust 95% IC 95% IC Exposición 1 34 1.0 1.0 2 42 1.4 1.57 (0.8-3.5) (0.6-4.2) 3 46 1.63 1.91 (0.7-4.0) (0.8-4.9) 4 47 1.69 1.74 (0.7-4.3) (0.6-4.7) p (tendencia) 0.21 0.18

y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO MUTACIONES DE p53 y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO MUTACIONES OR OR ajus CASOS 95% IC 95% IC Exposición 1 28 1.0 1.0 2 36 1.44 1.77 (0.5-4.0) (0.9-7.6 3 46 2.24 2.61 (0.8-6.1) (0.9-4.8 4 36 1.45 1.53 (0.5-4.2) (0.5-4.7 p (tendencia) 0.28 0.24

CONCLUSIONES Los tumores de vejiga asociados con más altos niveles de exposición al As muestran aumento de la inestabilidad cromosómica

CONCLUSIONES El número de aberraciones cromosómicas se incrementa con el estadio tumoral y el grado (p>0.001),independiente de la exposición al As, pero NO se asoció con historia de tabaquismo

CONCLUSIONES La mayoría de los cambios cromosómicos específicos que se relacionan con el As estuvieron asociados también con el estadio y el grado de los tumores, lo que sugiere que posiblemente la exposición al Arsénico podría determinar mayor agresividad en los carcinomas de células transcicionales.

La mutación de p53 en tumores vesicales aumentaron con CONCLUSIONES La mutación de p53 en tumores vesicales aumentaron con el estadio y el grado tumoral, pero no con el grado de exposición al As.

CONCLUSIONES La exposición al As en el agua de beber no es fuerte inductora de mutaciones en p53.

CONCLUSIONES La inestabilidad genética asociada con la exposición al As en tumores vesicales probablemente ocurre por un mecanismo independiente de p53.