Aislamiento de un bacteriófago Dr. Jesús Lee-Borges Dr. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Rivera Dr. José A. Cardé-Serrano Universidad de Puerto Rico en Aguadilla

Objetivo Utilizar dos métodos para aislar el bacteriófago de las placas preparadas en el laboratorio anterior.

Bacteriófago M13 These phages are about 900nm long and 9nm in diameter and the particles contain 5 proteins. Filamentoso Forma de baston o rod Genoma DNA INFecta bacts Gram Neg The major coat protein is the product of phage gene 8 (g8p) and there are 2,700 - 3,000 copies of this protein per particle, together with approximately 5 copies each of four minor capsid proteins, g3p, g6p, g7p and g9p which are located at the ends of the filamentous particle. The primary structure of the major coat protein g8p explains many of the properties of the particle. Mature molecules of g8p consist of approximately 50 amino acid residues (a signal sequence of 23 amino acids is cleaved from the precursor protein during its translocation into the outer membrane of the host bacterium), and is almost entirely alpha-helical in structure so that the molecule forms a short rod. There are three distinct domains within this rod: * A negatively-charged region at the amino terminal end which contains acidic amino acid residues and which forms the outer, hydrophilic surface of the virus particle * A basic, positively-charged region at the carboxyl terminal end which lines the inside of the protein cylinder adjacent to the negatively-charged DNA genome * A hydrophobic region which is responsible for interactions between the g8p subunits which allow the formation of and stabilize the phage particle.

Datos Básicos Filamentoso DNA circular hebra sencilla 6400 pares de bases de largo El genoma codifica para un total de 10 genes (nombrados con los números romanos del I al X) Filamentoso Forma de baston o rod Genoma DNA ss INFecta bacts Gram Neg

Genes Ensamblaje: I, IV, VII, IX Replicacion: II, X, Atachtment: VI, Capsula: VIII,

a) Adenovirus b) Rotavirus c) Influenza virus d) Vesicular stomatitis virus e) Tobacco mosaic virus. f) Alfalfa mosaic virus g) T4 bacteriophage. h) M13 bacteriophage filamentous bacteriophage M13 SEM: The image was taken with a Philips XL30 ESEM in STEM mode, the bright field image (BF) was subtracted from the dark field image (DF) for contrast enhancement. The sample was prepared on a holey film (Quantifoil) and rotary shadowed with platinum / carbon (95/5 w%) under a low angle. The bright spots have their origin in imperfections of the foil,

Datos Básicos (cont.) Gen VIII codifica para las principales proteinas estructurales de la particula del bacteriofago. Gen III codifica para las proteinas (minor proteins) de la capsula.

Objetivo Contar las placas de bacteriófagos que son visibles en la placa de agar. Estos son los que visualizaremos como puntos claros en el área opaca de la placa de agar.

Ensayo en placas PFU (Unidades de formación de placas) Placa – Región clara en el césped de bacterias Infección lítica Lisis de la bacteria PFU = # de placas x factor de dilución 30 – 300 PFU = # de plaques X factor dilucion Unidad para titular un stock de virus Pfu: se obtiene de # de manchas y la dilucion usada Diluciones: Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo y añades mas del segundo, bajando la concentración del primero. Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal! Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó. C1V1=C2V2     Lo importante aquí es definir las variables bien.   Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua. Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la dilución? Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables: C1= concentración inicial, 0.2M V1= volumen inicial, 10ml C2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan! V2= volumen final, _____ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final!!! Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto mas diluído esta una solución resultante preparada a partir de una solución “stock”. Se calcula como el volumen final dividido entre el volumen inicial. Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior? 100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas concentrado... factor de dilución es 10 Una vez tienes el factor de dilución que hacer? o lo multiplicas (decima o fraccionl) por la C1 o divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2=0.2M/10=0.02M o C2=C1xfd = 0.2M x 1/10 la [ ] será 1/10 de la original! Diluciones Múltiples: Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula : Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3 FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces… Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1 PFU = 4 x(10X10X10x10x10) = = 4 x (100,000) = 400,000

Parte Práctica I Utilizarán 2 placas (las que poseen las diluciones de 10-5 y 10-6) para extraer el bacteriófago utilizando “Tryptone broth” y centrifugación.

Protocolo Tomar 5 ml de Tryptone broth y lavar la placa de 10-5 por 5 minutos en el “orbital shaker” a temperatura ambiente. Sacar los 5 ml de Tryptone broth de la placa de 10-5 y transferirlos a la placa de 10-6 y lavar por 5 minutos en el “orbital shaker” a temperatura ambiente. Sacar los 5 ml y colocarlos en un tubo de ensayo esterilizado. Centrifugar por 20 minutos en la centrifugadora clínica. Pasar el sobrenandante a un tubo de ensayo estéril Guardar a 4°C

Orbital Shaker

Centrífuga Clínica Nevera 4oC

Parte Práctica II Utilizar la placa con la dilución de 10-4, o la placa donde tengan “plugs”, para extraer una placa del bacteriófago. Utilice la punta de una micropipeta y centrifugue.

Protocolo II Sacar con una punta de una micropipeta una placa de un tamaño grande. OJO UNA SOLA PLACA. Colocar la placa en 5 ml de “Tryptone broth” y centrifugar por 20 minutos. Pasar el sobrenadante a un tubo de ensayo estéril. Guardar a 4°C. En el sobrenadante se encuentra el bacteriófago en el pellet los residuos de bacteria muertas. El bacteriófago logró hacer lisis y matar la bacteria.

OJO Los tubos de ensayo con el “Tryptone broth” contienen 10ml. Al finalizar el laboratorio usted debe tener dos tubos de ensayo, claramente rotulados, con aproximadamente 5 ml cada uno y el bacteriófago.

¿Preguntas?