Tema 5 Protocolos para obtención de datos, calibrados, uso de hojas de cálculo

Etapas de una investigación Análisis : tests estadísticos, ajuste de curvas , …. Exploración de datos Obtención datos, calibrados, etc. Para hacer un buen análisis de datos hay que seguir sistematicamente unos pasos que no se deben omitir. Lo primero de todo es el diseño del experimento (plantearlo correctamente), viene luego la exploración exhaustiva de los datos y por último el análisis propiamente dicho. Veremos brevemente algunas ideas sobre el diseño de experimentos y luego nos centraremos en la exploración de datos que es el tema principal de esta charla. Diseño del experimento Antecedentes Bibliográficos

Diferentes protocolos para diferentes estudios (1/2) 1) Estudios experimentales (por ej. : Determinar la Km y Vmax de una enzima usando regresión no lineal): a) Concretar el procedimiento experimental. b) Preparación de disoluciones y comprobar su estabilidad en el almacenamiento. c) Rectas de calibrado: - Diferencia entre precisión y exactitud. Estimación de una media con intervalo de confianza (barras de error) - Ajuste de una recta a los datos por regresión lineal, bandas de confianza. - Predicción inversa. d) Hacer las medidas experimentales del estudio, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos. El diseño de un experimento comienza estableciendo una pregunta precisa a la que se quiere responder e identificando la técnica estadística que se va a seguir para analizar los resultados. Por ej.

Diferentes protocolos para diferentes estudios (2/2) 2) Estudio observacionales (por ej. comparación de la eficacia de un nuevo fármaco en pacientes tratados con dicho fármaco frente a placebo (test t de student)): a) Elegir la población objeto del estudio. b) Establecer el tamaño de muestra, el tipo de aleatorización, tipo de “ciego”. c) Elaboración de encuestas o de procedimientos de medida. d) Hacer las observaciones o medidas. e) Recopilar los datos en una tabla de EXCEL. El diseño de un experimento comienza estableciendo una pregunta precisa a la que se quiere responder e identificando la técnica estadística que se va a seguir para analizar los resultados. Por ej. (En lo que sigue nos ocuparemos principalmente de lo estudios experimentales)

a) Establecer primero el protocolo experimental Procedimiento Termostatar 1) 100 mL enzima 2) 100 mL sustrato 3) 9.6 mL disolvente 4) 0.2 mL agua 10 mL total Toma de muestra Si se trate de diseñar experimentos del tipo ajuste de curvas, por ejemplo velocidad-[Sustrato], para determinar la Vmax y la Km de una enzima, habrá que proyectar el experimento teniendo en cuenta el margen de la variable controlada (normalmente el más amplio posible), el nº de puntos, el espaciado entre ellos…etc. La simulación por ordenador nos puede ayudar a decidir entre las diferentes posibilidades. 1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h) 2) 200 mL muestra + 400mL tampón Medida de absorbancia

Se suelen hacer réplicas de muestreo Enzima + Sustrato ¡CV(%) grande! Réplicas de muestreo (3 réplicas a cada sustrato) Se toman alícuotas Si se trate de diseñar experimentos del tipo ajuste de curvas, por ejemplo velocidad-[Sustrato], para determinar la Vmax y la Km de una enzima, habrá que proyectar el experimento teniendo en cuenta el margen de la variable controlada (normalmente el más amplio posible), el nº de puntos, el espaciado entre ellos…etc. La simulación por ordenador nos puede ayudar a decidir entre las diferentes posibilidades. Medida Absorbancia ¡CV(%) pequeño! No suele ser necesario réplicas de técnica

¿Cuántas réplicas se deben hacer? 1) Cuando se desea estimar la media: nº réplicas CV(%) 1 2 3 4 5 (La media se estabiliza a partir de 3) 2) Cuando se desea estimar la desviación estándar: CV(%) Si se trate de diseñar experimentos del tipo ajuste de curvas, por ejemplo velocidad-[Sustrato], para determinar la Vmax y la Km de una enzima, habrá que proyectar el experimento teniendo en cuenta el margen de la variable controlada (normalmente el más amplio posible), el nº de puntos, el espaciado entre ellos…etc. La simulación por ordenador nos puede ayudar a decidir entre las diferentes posibilidades. (La desviación estándar se estabiliza a partir de 5) 1 2 3 4 5 nº réplicas

b) Preparación disoluciones en base al protocolo 1) 100 mL enzima 2) 100 mL sustrato 3) 9.6 mL disolvente 4) 0.2 mL agua 10 mL total Procedimiento: A preparar: [E] = 100 mg /mL [S] = 200 mg /mL Se desea en reactor: [E] = 1 mg /mL [S] = 2 mg /mL Hacia atrás 0.9 mg/mL 1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h) 2) 200 ml + 400ml tampón [S] = 0.3 mg/mL (Multiplicar por 3) Hacia adelante Si se trate de diseñar experimentos del tipo ajuste de curvas, por ejemplo velocidad-[Sustrato], para determinar la Vmax y la Km de una enzima, habrá que proyectar el experimento teniendo en cuenta el margen de la variable controlada (normalmente el más amplio posible), el nº de puntos, el espaciado entre ellos…etc. La simulación por ordenador nos puede ayudar a decidir entre las diferentes posibilidades.

Obtener datos sin artefactos Buenas prácticas experimentales: Hacer bien referencias en la técnica analítica Analizar bien controles o blancos. Comprobar exactitud y línea base de aparatos Buenas prácticas numéricas: Por último al diseñar un experimento hay que asegurarse de obtener los datos sin artefactos. Existen buenas prácticas experimentales que el investigador debe haber tenido en cuenta ( ), así como buenas prácticas numéricas ( ) Para cálculos elegir unidades para que los valores sean del orden de “ 1 ” (ej. 3.2 mM es mejor que 0.0000032 M o 3.2.10-6 M) Trabajar con los valores de todas las réplicas (no sus medias), para que los tests estadísticos en el ajuste de curvas tengan los grados de libertad correctos.

Recordatorio de cifras significativas Concepto de cifra significativa : Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Recordatorio de reglas para los cálculos Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Diferencia entre precisión y exactitud. Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Simil para diferencia entre precisión y exactitud. Imaginemos el tiro con carabina a una diana: Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso Error absoluto y error relativo Error absoluto: Error relativo:

Estimación de una media por intervalo de confianza Población: niños españoles al nacer Muestra grande 3.5 3.7 2.8 3.3 ….. Variable: Peso en kg Intervalo de confianza Límites de confianza Población: células en un cultivo Variable: nº células/mL Réplicas 6.2 106 6.8 106 5.9 106 Muestra pequeña

Recordatorio de la distribución normal Basado en J.P. Domènech (Bioestadística) Normal: Normal estandarizada: Entre las funciones de distribución de probabilidad, la más importante es la distribución normal o Gaussiana. Se

Comportamiento de las medias de diferentes muestras sacadas de una población (Teorema del límite central) Adaptado de J.P. Domènech (Bioestadística) Se toman infinitas muestras al azar de tamaño “n” Población medias Población origen (x) Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Puntualizaciones acerca de la varianza y desviación estándar En la población En un muestra (se hace la corrección de Bessel y en vez de n se pone n-1)

En general la estima de m de la población desde una muestra grande: Generalización para la estimación de una media por intervalo En general la estima de m de la población desde una muestra grande: Donde: desvío para riesgo a, normalmente: a=0.05 ((1-a)=0.95 (95%) ) Donde: “t” Student con n grados de libertad y riesgo a n= n-1 a=0.05 ((1-a)=0.95 (95%) ) La estima de m de población desde una muestra pequeña: Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Ejemplo: estimación de medias con intervalos al 95% Muestra 3 5 % Muestra 1 Muestra 2 Muestra 83 Muestra 3

Ejemplo: simulación de medias con intervalos al 95% Simulamos al azar: 7 muestras de 10 datos: Muestra 5 Muestra 4 Muestra 1 Muestra 6 Muestra 2 Muestra 7 Muestra 3

Otros tipos de límites de confianza (barras de error) 3 datos LC 95% 3 datos barras 1s 7 datos LC 95% 7 datos barras 1s 30 datos LC 95% 30 datos barras 1s

Cálculo de límites de confianza (SIMFIT) Statistics > Statistical calculations > Estimate parameter confidence limits

Cálculo de límites de confianza (SIMFIT) Número de sujetos: n = 20 Media en la muestra: Desviación estandar muestra: % de confianza: 95 Ejemplo: 13.1-------15.0------16.9 15.0 1.9 O también:

c) Rectas de calibrado y predicción inversa Ajuste de una recta por regresión lineal simple y bandas de confianza El llamado método de Allen se utiliza para medir concentraciones de fosfato en base a una reacción coloreada con molibdato. Para ello hay que hacer primero la recta de calibrado o ley de Beer a partir de unos patrones de fosfato. Predicción inversa Evaluación Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso SIMFIT

Evaluación y predicción inversa c) Rectas de calibrado y predicción inversa. Evaluación y predicción inversa Evaluación: Se introduce la “x” y se desea la “y” (no suele tener interés) Predicción inversa: Se introduce la “y” y se desea la “x” (es lo que interesa, medir la absorbancia de una muestra y estimar la [fosfato]) 0.231 0.472 Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso SIMFIT

d) Hacer las medidas experimentales del estudio de que se trate, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos. Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso

Manejar bien hoja de cálculo Excel 1) Combinar celdas: Inicio > Combinar y centrar > Ajustar texto 2) Insertar gráficos, por ejemplo línea recta ajustada por regresión lineal Seleccionar celdas > Insertar > Dispersión > primer estilo > se despliega una barra herramientas > Deplegar tipos con y seleccionar cuadro con fx (aparece la recta de ajuste y su R2 . 3) Introducir una fórmula sencilla, por ejemplo: (celda1 + celda 2)*7/100 =(A1+B1)*7/100 4) Opción autocompletar : se propagan los cálculos de una fórmula si uno arrastra la celda con la fórmula estirando con el cursor en la esquina derecha). 5) Utilización de funciones: por ej. función SI…… Fórmulas > Insertar función > SI (Prueba_lógica; valor_si_verdadero; valor_si_falso)

Existen muchas funciones en Excel

Otras herramientas de Excel 1) Ordenar y filtrar: Ordenar: Ordenar de menor a mayor, ordenar de mayor a menor, ordenar de A a Z, ordendar de Z a A. Filtrar: Ej: Seleccionar la columna deseada > ordenar y filtrar > filtrar > Se despliega arriba en la columna una flecha > filtros de número > inferior al promedio 2) Tablas dinámicas para resumir datos: Insertar > tabla dinámica

Aspectos avanzados de la hoja de cálculo Excel: uso de macros Abble bits (Merge Tables wizard) SIMFIT6.XLS Si se trata de diseñar experimentos a los que se les van a aplicar tests estadísticos de contrastes de hipótesis, por ejemplo de tipo comparación de 2 medias por el test “t”, habrá que calcular el tamaño de muestra necesario para detectar una determinada diferencia entre ellas (si es que existe). Así en el caso