Microb. Ariel Massera Centro de Estudios Enológicos EEA Mendoza - INTA Nuevas estrategias biotecnológicas aplicadas en la elaboración de vinos tintos

INTRODUCCION Orígenes del vino Siglo VI A.C.

INTRODUCCION Orígenes del vino La vid se extiende por Europa Alteraciones Levaduras transforman el azúcar en alcohol (1866)

INTRODUCCION Ácido L-láctico Ácido L-málico Etanol Azúcares Fermentación de vinos Ácido L-láctico Ácido L-málico O. oeni Etanol Azúcares S. cerevisiae Tiempo (días) Viabilidad (Log UFC/mL) Levaduras Bacterias Lácticas

INTRODUCCION O. oeni Ácido Alcoholes superiores Acido acético L- láctico Acido acético Etanol Diacetilo Saccharomyces cerevisiae O. oeni Glicerol Toxina killer Acido acético Compuestos azufrados Enzimas Ésteres

Fermentaciones espontáneas INTRODUCCION Población inicial variable Fermentaciones espontáneas Demoras en arrancar Producto con características variables Tiempo (días) Viabilidad (Log UFC/mL) Levaduras Bacterias Lácticas

Fermentaciones inoculadas INTRODUCCION Fermentaciones inoculadas Levaduras Bacterias Lácticas Viabilidad (Log UFC/mL) Tiempo (días)

INTRODUCCION Fermentaciones inoculadas Problemas Solución Rápido inicio de la fermentación Reproducibilidad del producto Cepas no adecuadas (Malbec) Problemas de adaptación Problemas Baja implantación Pérdidas de biodiversidad Pérdida de tipicidad Selección de microorganismos en cada región vitivinícola Solución

OBJETIVO GENERAL Seleccionar y caracterizar microorganismos nativos con diferentes aptitudes enológicas para la optimización de procesos fermentativos específicos y aumento de la calidad y/o tipicidad de los vinos tintos producidos en nuestra región

OBJETIVO PRIMERA PARTE Seleccionar y caracterizar cepas de O. oeni nativas aptas para realizar la FML en vinos tintos de nuestra región, optimizar el tiempo de inoculación de la misma con el objeto de incrementar el porcentaje de éxito de esta fermentación y evaluar la compatibilidad microbiana existente entre diferentes cepas de S. cerevisiae y O. oeni.

Fermentaciones inoculadas Levaduras Bacterias Lácticas Tiempo (días) Viabilidad (Log UFC/mL) Bacterias Lácticas

CARACTERIZACION ENOLOGICA Preselección cepa nativa L28 RESULTADOS CARACTERIZACION ENOLOGICA pH: 2,9 - 4,3 T: 10 – 28 ºC Etanol: 2 - 18% SO2: 2 - 35 mg/L libre Degustación: preferido Cepas nativas de O. oeni Preselección cepa nativa L28

RESULTADOS INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala laboratorio) Cultivo O. oeni S. cerevisiae Mosto concentrado tinto tindalizado 24 Brix pH 3,6 25 ºC

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala laboratorio) RESULTADOS INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala laboratorio) No hubo efecto de la inoculación sobre La viabilidad de las levaduras y la duración de la FA. Se produjo una marcada disminución de la viabilidad de las BAL y la degradación del ácido L-málico fue incompleta.

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala laboratorio) RESULTADOS INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala laboratorio) Cultivo comercial O. oeni Cultivo comercial S. cerevisiae Mosto tinto Malbec 25 Brix pH 3,6 50 mg/L SO2 25 ºC Ma

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala piloto) RESULTADOS INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala piloto) No hubo efecto de la inoculación sobre: Viabilidad de las levaduras. Duración de la fermentación alcohólica.

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala piloto) Efecto sobre la cinética de FML INTA MZA Uvaferm alpha BAL nativas Ácido L-málico BAL alcanzan 106-107 ufc/mL FML finaliza en 2 semanas Inoculación simultanea BAL nativas degradan 20% ácido L- málico FML finaliza en 3 semanas Inoculación al final

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala piloto) Efecto sobre la cinética de FML INTA MZA ICV D80 Uvaferm alpha Ácido L-málico Las cepas de levaduras afectan de diferente manera la cinética de la FML Inoculación simultanea

INOCULACIÓN SIMULTANEA (escala piloto) Efecto sobre la cinética de FML ICV D80 Uvaferm alpha Ácido L-málico Una misma cepa de levadura afecta de diferente manera la cinética de la FML en mostos diferentes Inoculación simultanea

Análisis sensorial INTA MZA T1 ICV D80 T1 INTA MZA T2 ICV D80 T2

CONCLUSIONES Permitió el desarrollo de la FA y FML, sin afectar la viabilidad de los microorganismos responsables. Se acortó el tiempo total de fermentación (FA+FML), sin afectar negativamente la composición química y los atributos sensoriales de los vinos. Realizar una correcta elección de las pares a utilizar. Considerar el efecto que ejerce el sustrato en la interacción microbiana.

OBJETIVO SEGUNDA PARTE Seleccionar y caracterizar cepas nativas de S. cerevisiae para la fermentación de vinos tintos a bajas temperaturas, con especial consideración de los procesos de producción de aromas y adaptación al frío.

SELECCION Establecer el objetivo-fundamento Establecer los criterios de selección Fermentación espontánea de varios mostos Aislamiento de cepas Análisis químico y sensorial Identificación molecular (especie y cepa) Caracterización enológica de las cepas Primera selección

Objetivo-Fundamento Fermentar mostos tintos a bajas temperaturas (15 ºC) Vinos jóvenes con frutos rojos intensos Mantener o incrementar el color Mantener o disminuir astringencia Mantener o disminuir la acidez

Criterios de selección enológicos Capacidad de llevar a cabo la fermentación alcohólica a 15 ºC Velocidad de fermentación Producción mínima de acidez volátil Osmotolerancia Vigor fermentativo Baja formación de espuma Baja producción potencial de H2S Tolerancia al SO2 Tolerancia al etanol Producción de compuestos volátiles fermentativos Carácter killer

Vendimia 2005 y 2006 Ma Sy Bo Te Ca ¾ FA Final FA 50 mg/L SO2 15 ºC Tunuyán Tupungato Santa Rosa Drummond ¾ FA Final FA

Identificación a nivel de especie (patrón RFFLP fragmento ITS) Enzimas de restricción: 1 = Hae III; 2 = Hpa II; 3 = Scrf I Marcador de peso molecular: M = 100 bp 1 2 3 1 2 3 1 2 3 M

Identificación de cepas de S. cerevisiae 17 cepas de S. cerevisiae con un patrón molecular único Cepas duplicadas M 1 2 3 4 5 6 M 7 8

Mosto tinto concentrado tindalizado Caracterización enológica de las cepas Cultivo mono-cepa preadaptada Mosto tinto concentrado tindalizado 24 Brix pH 3,6 15 ºC

Caracterización enológica de las cepas

12 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas Caracterización enológica de las cepas 12 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas

Caracterización enológica de las cepas - + ++ +/- ++ +++

Caracterización enológica de las cepas

8 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas Caracterización enológica de las cepas 8 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas

Fermentación mosto Malbec (5 L) 50 mg/L SO2 15 ºC

Análisis químicos de las microvinificaciones 7 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas

Control de implantación de microvinificaciones M C I I I I I I I I I I M

Análisis sensorial de las microvinificaciones 4 cepas de S. cerevisiae con características adecuadas

Vinificación bodega

Análisis sensorial

CONCLUSIONES PARCIALES En nuestra región se encuentran levaduras nativas con potencial enológico para fermentar mostos tintos a bajas temperaturas. Las cepas de levaduras comerciales evaluadas no presentan características enológicas adecuadas para este tipo de fermentación.

CONCLUSIÓN En nuestra región se encuentran microorganismos capaces de ser empleados para la elaboración de vinos tintos. Estos microorganismos pueden ser utilizados para mejorar los procesos fermentativos habituales o para obtener vinos más aromáticos mediante nuevos procedimientos de elaboración.

Muchas Gracias

CINETICA DE FERMENTACION SELECCION CINETICA DE FERMENTACION PARAMETROS MEDIBLES Velocidad de fermentación (Ve F): cantidad de CO2 producida durante de 3 días de fermentación (CO2/d). Se consideraran tres días durante la fase exponencial. Eficiencia de fermentación o rendimiento (EF): gramos de azúcar necesarios para producir 1 grado alcohólico EF: (az inicial – az residual)/ etanol producido

CINETICA DE FERMENTACION SELECCION CINETICA DE FERMENTACION PARAMETROS MEDIBLES Pureza fermentativa (PF): cantidad de etanol producido en relación a la acidez volátil producida (% etanol v/v / g AV/L). PF= % etanol x 100 / AV (indica por cada etanol producido que % de AV se produce). Vigor fermentativo (Vi F): máxima cantidad de etanol producido en condiciones de exceso de azucares (300mg/L)