Tema 17 Reacciones multisustrato Reacciones enzimáticas con dos sustratos 1. Introducción 2. Nomenclatura 3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos. 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos 4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. 4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado. 4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong

- Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas: 1.Introducción Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación enzimática de un sustrato en un único producto. S + E <==> ES <==> EP <==> E + P Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales, restringidos a reacciones de isomerización. Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato, transformándolos en varios productos son las más frecuentes. - Por ejemplo: A + B  P + Q - Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas:

Adenilato ciclasa. Citrato sintasa. Alcohol-DH. Malato-DH. Ribitol-DH Adenilato ciclasa Citrato sintasa Alcohol-DH Malato-DH Ribitol-DH Lactato-DH Coenzima-A transferasa Glutamato-alanina transaminasa Glucosa oxidasa etc. .... Estudio cinético: A) Velocidad inicial B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los reactantes (Resto saturación). Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno

2. Nomenclatura a) En cuanto al número de sustratos y productos: Reacción Nombre A -----> P Uni-Uni A + B -----> P Bi-Uni A + B -----> P + Q Bi-Bi A + B + C -----> P + Q Ter-Bi b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los productos: * Reacciones secuenciales: - al azar - ordenadas * Reacciones de desplazamiento: - Ping-Pong

El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser bastante complicado a la hora de representar los esquemas de las reacciones A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland. De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la reacción se simboliza por una línea horizontal. La entrada de sustratos y la salida de productos se representan por flechas verticales que indican la dirección de entrada o salida de la reacción. - Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos y se forman 2 productos:

E EA EAB A B EQ P Q EPQ Secuencial: Bi-Bi ordenada E EA A P EB B Q Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong

¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos? P Q C a) E A B C Q P b) R E A B C Q P c) R

3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi: A + B --- P + Q Mecanismos secuenciales al azar ordenadas - Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

Mecanismos secuenciales, Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo ternario EAB o EBA debe formarse como requisito indispensable antes de que se produzca la formación de productos. La formación del complejo ternario es independiente del orden de unión de los sustratos. Este tipo de reacciónes se denominan  reacciones secuenciales al azar, La formación del complejo ternario debe producirse en un orden determinado para que el complejo sea productivo desde el punto de vista catalítico. Este tipo de reacción se denomina  reacciones secuenciales ordenadas).

Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico: Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos de reacciones secuenciales. Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico: Bi-Bi al azar E + A <=> EA E + B <=> EB EAB <=> EPQ EQ <=> E + Q EP <=> E + P B A P Q Bi-Bi ordenado E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q

Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland: Bi-Bi al azar E A B EA EB EAB Q P EP EQ EBA EPQ EQP Bi-Bi ordenada E EA EAB A B EQ P Q EPQ

- Un caso especial, es el siguiente: EA A B EQ P Q - Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni EPQ La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido

B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se genera una forma modificada de la enzima. (acil enzimas, fosforil enzimas) Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del segundo producto con regeneración de la forma nativa de la enzima. E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q - Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es decir en reacciones de transferencias.

Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping Pong * Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones Ping-Pong, tenemos: E EA A P EB B Q Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping Pong

¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la siguiente reacción? Succinil-CoA HSCoA Pi Succinato GDP GTP Succinil-E E-P

(Eo) = (EXi) 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P Supondremos la formación de un equilibrio rápido: entre la E y los S b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la enzima: (Eo) = (EXi) c) Supondremos la existencia de condiciones de estado estacionario

4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. EA EB EAB kcat KA KB KMAB KMBA EBA A + B P +Q v = kcat [EAB=EBA] E + P+ Q B A KM es la concentración de Substrato en el cual v=1/2 Vmax cuando el otro substrato está saturante

v = kcat [EAB] [ ] E A B EA EB EAB kcat KA KB KMAB KMBA EBA K E EAB EB + = E + P+ Q v = kcat [EAB] Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar

ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar

Un substrato constante pero no saturante Constante [A] Ver anexo 1

Constante [B] Igual se hace para [B] constante pero no saturante

Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas Vmax V`max KMBA [A] cte [B] cte Vmax V`max KMAB [B] K` [A] KB KMAB K` [B] KA KMBA [A] =0

Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante [B] se hace muy grande, -->  , condición de saturación [B] Muy grande Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten

Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante [A] se hace muy grande, -->  , condición de saturación [A] Muy grande Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten

4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado KA KmAB kcat V=kcat[EAB]

Constante B [B] Vmax Regresión No-linear V`max Vmax KMAB KA K` [B] Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B [B] Vmax Regresión No-linear V`max Vmax KMAB KA K` [B]

Constante A Pendiente es igual: KA KAB K` KMAB [A] ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO BIBI ORDENADO: Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato: Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima

4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong No hay complejo ternario k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3 KMA KMB O con la nomenclatura de Cleland: E EA E* A P E*B B Q - Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales.

La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3 KMA KMB La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB v = k4 [E*B] Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO BI BI PING PONG Paso limitante

Constante B [B] Vmax Regresión No-linear V`max Vmax KMB KMB KMA K` Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B [B] Vmax Regresión No-linear V`max Vmax KMB KMB KMA K` KMB [B]

Constante A Regresión No-linear [B] Vmax V`max Vmax KMA KMA KMB K` KMA [B]

DIFERENCIACIÓN MECANISMOS K` Ping-Pong Ordenada Al azar [B] Al azar K` Ping-Pong Ordenada [A]

Mecanismo Enzima Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3) Creatin quinasa (EC 2.7.3.2) Citrato sintasa (EC 4.1.3.7) Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56) Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27) Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7) Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2) Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)

Inhibición por productos Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones que transcurren con dos substratos y dos productos A + B --- P + Q Mecanismo Inhibidor Substrato A (B saturante) B (A saturante) Bi-Bi ordenado P Q Acompetitiva Competitiva No competiva ------------------ Ping Pong ----------------- Bi-Bi al azar No competitiva No Competitiva

RESUMEN Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos ,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero con respecto a todos los reactantes menos uno. En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato (mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado). Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes cinéticas que describen el proceso enzimático. La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos probables de reacción. En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.

Anexo 1 A constante Se divide

Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma AX +B Bx + A PROBLEMAS. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma AX +B Bx + A Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de substrato AX. Los resultados obtenidos. INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM 2.0 250 286 300 2.5 278 323 341 3.3 313 371 395 5.0 357 435 469 10.0 417 526 577 ¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?