Transferencia de material genético II Purificación restricción (Digestión) 17.04.12

SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

Plásmido Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.

Superenrrollamiento Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Características 1. ORIGEN DE REPLICACIÓN Capaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero 2. MARCADORES DE SELECCIÓN Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico 3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.

Son pequeños 5,000 -40,000 pb. Suelen llevar sólo uno o pocos genes. Molécula de DNA circular. Pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee. Son transmisibles. Resistencia a antibióticos.

Técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos Permiten obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular. La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño de ambos.

Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Puentes de hidrógeno de cadenas complementarias de DNA se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí. Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas.

La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas. Las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

Aislamiento de Plásmidos Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos: Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo Recogida y lisis de las bacterias Purificación del DNA plasmídico

Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.

Lisis celular con SDS/ NaOH 1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Disuelve la membrana Se une a las proteínas y las desnaturaliza 2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los puentes de hidrógeno entre ambas cadenas)

Neutralización 2.- Acetato de potasio/ ácido acético Neutraliza el NaOH (renaturalización de DNA plasmídico, se restablecen los puentes de hidrógeno). B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Dodecil Sulfato de Potasio (PDS)‏ (H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)‏

Determinación de concentración de DNA

Pureza del DNA Determinación de pureza A260/A280 Relación de 1.9-2.0 alta pureza Determinación de contaminantes de DNA Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea

DNA plásmidico separado de los contaminantes por centrifugación       El sobrenadante contiene:          - El DNA del plásmido          - Los componentes celulares solubles           Pellet contiene:          - PDS          - Lípidos          - proteínas          - El DNA cromosómico

Restricción Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Enzimas de restricción · Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

Enzimas de restricción Tipo I Una sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN, Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Tipo II Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.

Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda)

Extremos romos

Extremos cohesivos

Enzimas de restricción Nomenclatura Ejemplo Corresponde a: E Escherichia Género de la bacteria co coli Especie de la bacteria R RY13 Cepa de la bacteria I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima

Plásmido

Usos de las enzimas de restricción

Identificación de muestra