Transferencia de material genético II Restricción (Digestión)

Plásmido Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.

Características 1. ORIGEN DE REPLICACIÓN Capaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero 2. MARCADORES DE SELECCIÓN Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico 3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.

¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?

Electroforesis en geles de agarosa ¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos? Absorbancia 260 nm Electroforesis en geles de agarosa

Microscopia de polímero de agarosa

Uso de “colorantes”

1. BROMURO DE ETIDIO 2. SYBER SAFE

Tinción con Bromuro de Etidio

Tinción con Syber Safe

Sensibilidad del colorante SYBER-SAFE 50 25 12.5 6.25 3.125 50 25 12.5 6.25 3.125 ng Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con Bromuro de Etidio Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE

Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos 1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambio aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado

Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE 2X M 1kb - - + + NdeI - + - + BamHI Inserto Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE 2X El plásmido obtenido se resuspendió en 20 mL de H2O estéril. Posteriormente se tomaron 5 mL para realizar la digestión correspondiente.

Restricción Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Enzimas de restricción · Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)

Enzimas de restricción Nomenclatura Ejemplo Corresponde a: E Escherichia Género de la bacteria co coli Especie de la bacteria R RY13 Cepa de la bacteria I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima

Extremos romos

Extremos cohesivos

Plásmido

Usos de las enzimas de restricción

Identificación de muestra