PCR en Tiempo Real

ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl2 Buffer Fluorocromo

PCR en Tiempo Real PCR convencional

Ventajas Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

SYBR Green

Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

FAM: fluoresceína JOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceína TAMRA: tetrametil-rodamina ROX: rodamina X

LUX™ primers

Sondas TaqMan®

Molecular Beacons ®

Sondas Scorpions™

A mayor producto de amplificación mayor fluorescencia!!!!

Muestra ΔRn Rn Threshold Control Negativo Basal Ct Número de ciclos

Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX). Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia. Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia. Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias. ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.

Controles endógenos: β-Actina rARN 18S GAPDH β2-microglobulina

Métodos de cuantificación Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt: compara los Ct del gen testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores. (EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc) r= 2 -(ΔΔCt)

b) (Etarget)ΔCt target (control-muestra) r= (Eendógeno) ΔCt endógeno (control-muestra) E= 10 [-1/ pendiente]-1

Curva de disociación Contenido de GC. Secuencia y tamaño del amplicón.

Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt) Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina. Tejido calibrador: hígado de rata.

Curva de Rango Dinámico TRalfa

Curva de Rango Dinámico Beta Actina

Puesta a punto: cDNA Primers (Calibrador!!!!!)

Target: TRalfa (m y calibrador) Master Mix Endógeno: BetaActina(m y c) NTC!!!

Ej. Discriminación Alélica (Taqman) Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2. Alelos: Ala12 Pro12

Alelo 1 Alelo 2 Sonda 1 (FAM) Sonda 2 (VIC) Match Match Mismatch

Homocigota alelo 1: Heterocigota: Homocigota alelo 2: