MANTENIENDO LA DISTANCIA GENETICA: EVIDENCIA DE LA INTROGRESION ENTRE ESPECIES HIBRIDIZADAS DE GEUM EN CONTRASTE CON SU SISTEMA DE APAREAMIENTO

INTRODUCCION

 Trayectoria evolutiva de los linajes es su nivel de intercambio genético con taxones relacionados  Las poblaciones contemporáneas muestran evidencia generalizada de hibridación entre las especies hermanas de cruzamiento y endogamia  A diferencia de los pares de especies que se cruzan, los miembros de pares con sistemas de apareamiento contrastantes difieren en el potencial de introgresión y los procesos que lo causan  Sin embargo, es probable que la introgresión de cruzador cruzado a endogamia sea rara por retrocruzamiento a progenitores consanguíneos

 Una serie de factores potencialmente limitan la introgresión  La evolución de un síndrome de autofinanciación en las endogamias, la precedencia de polen conspecífico y la diferenciación ecológica entre las especies crea barreras prezigóticas a la introgresión  Barrera Pre y Postzigóticas  Especies tomadas en cuenta: G. rivale y G.urbanum

 Ambas especies son alohexaploides perennes y antiguas  Alohexploide se feriere a que las dotaciones genéticas derivan de diferentes especies  Las poblaciones de G. rivale que carecen de G. urbanum, y probablemente lo han hecho durante un largo período (poblaciones "alopátricas"), ocurren en comunidades montanas de hierbas altas en el Reino Unido y en sitios de latitudes altas en otros lugares de Europa. Las poblaciones de alopátricas de G. urbanum se producen en el sureste del Reino Unido, donde las precipitaciones son bajas (<650 mm / año), y en el sur de su área de distribución continental (Taylor, 1997a, 1997b).  En otras partes del Reino Unido y Europa continental, las especies se producen simpátricamente, ya sea solo o en poblaciones mixtas. El intermediario híbrido F1 9 altamente fértil se produce en poblaciones mixtas

 Adoptamos un enfoque genómico comparativo para cuantificar el intercambio genético tanto histórico como contemporáneo entre los dos taxones de Geum  Borrador del genoma de las especies consanguíneas  Aplicamos el análisis de coalescencia a estos datos para determinar la edad de los taxones y estimamos las tasas históricas de introgresión para contextualizar nuestro análisis de la introgresión contemporánea  Para probar el flujo de genes recientes entre los taxones de Geum, comparamos poblaciones alopátricas con muestras de un área amplia de simpatría

Objetivos  Verificamos si las frecuencias alélicas de una posible población híbrida reflejan desproporcionadamente las frecuencias alélicas de una posible población parental  Comprobar si la diferenciación genética entre especies en alopatía supera la simpatía, como se espera con la introgresión  Aplicar un análisis de agrupamiento de genotipos de SNP multilocus para comprobar si la mezcla de individuos de G. rivale supera la de G. urbanum  Puntuar muestras simpátricas utilizando SNPs de diagnóstico de especies para cuantificar la introgresión para individuos  Relacionamos las estimaciones de la hibridez de un individuo con su morfología para probar si la morfología de una planta refleja su estado híbrido genotípico y para probar si la morfología varía con los loci de RAD centrales.

METODOS

Muestreo Muestreo de poblaciones alopátricas

Encima de los limites altitudinales Un individuo, una población al norte de Suecia e Islandia Cordillera escocesa G.rivoli

Al sueste, 10m poblaciones Una muestra de Portugal y otra de Francia Se retiraron 0,5 g de tejido de hoja joven de las plantas muestreadas y se almacenaron en seco en gel de sílice G. urbanum

Muestreo de poblaciones simpátricas.

 Muestreamos los sitios (a) con ambas especies presentes y (b) donde cada especie vivió individualmente  Definimos ampliamente las poblaciones "simpátricas" como localidades donde (en ausencia de selección) la introgresión reciente debería ser posible  Se buscó en la base de datos de BSBI  G. rivale solo (15), G. urbanum solo (14) o ambos taxones (10), Islas Británicas  En sitios mixtos, se recolectaron esquejes de cuatro plantas Geum seleccionadas al azar  96 de los 98 cortes se enraizaron con éxito en macetas  Las hojas recién emergidas (0,1 g / planta) se congelaron (~ 80 ° C) antes de la extracción del ADN

Desarrollo de marcadores SNP vía ddRAD

Estrategia global  1.6 y 1.2 Gb en G. urbanum y G. rivale, respectivamente  ddRAD permite la modulación del número de etiquetas RAD generadas por genoma  En este método, el ADN genómico se digiere primero con una enzima de restricción y un adaptador P1 con código de barras ligado a los fragmentos. Los fragmentos ligados al adaptador de diferentes muestras se combinan, si las muestras se multiplexan, y el ADN se digiere con una segunda enzima de restricción.  Secuenciación de extremos pareados (PE), permite a los usuarios secuenciar ambos extremos de un fragmento

Extracción de DNA  El ADN se extrajo de las muestras secas utilizando una modificación del protocolo CTAB de Doyle y Doyle (1990), mientras que el material fresco y congelado se extrajo utilizando el kit de preparación mini DNeasy (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante

Desarrollo del borrador de genoma  El individuo más homocigoto  Extrajimos 17 μg de ADN de 150 mg de hojas jóvenes  Las lecturas se generaron con3 bibliotecas Illunima  Una biblioteca de 151 extremos emparejados con un tamaño de inserción promedio de 400 =144 millones de pares de lectura),  Una biblioteca de 151 pares con un tamaño de inserción promedio de 600 =134 millones de pares de lectura  Una biblioteca de 251 pares emparejados con un tamaño medio de inserción de 400 = 11.9 millones de pares de lectura

 Los adaptadores de Illumina se eliminaron y las lecturas se recortaron utilizando la versión 1.3 de cutadap, que permite recortal las colas Poli-A  Las lecturas recortadas se ensamblaron en contigs y andamios utilizando MaSuRCA versión

Preparación y secuenciación de la biblioteca ddRAD.  Sistema de electroforesis de agarosa prefabricada E-Gel, calidad de DNA  Kit de ensayo Qubit dsDNA BR, está diseñado específicamente para su uso con el fluorómetro Qubit. El ensayo es altamente selectivo para el ADN de doble cadena  La preparación de la muestra, la construcción de la biblioteca y la amplificación por PCR para la secuenciación RAD de doble digestión se modificaron de Peterson  Se agruparon en una Illumina HISEQ 2500 superagrupaciones de productos de PCR utilizando 125 lecturas de PE de pares de bases en modo de alto rendimiento (química v4) o una MISEQ de Illumina usando lecturas de PE de 150 bases (química v2).

Calidad de filtrado y preparación de lecturas desde ddRAD.

Alinear las lecturas al borrador del genoma.  Exploramos el efecto de variar el número de desajustes permitidos (M) en el mapeo de lectura para un individuo alopátrico de cada especie (Punnetts Town, G. urbanum; Ben Lui, G. rivale; ambos secuenciados con Illumina HISEQ).  Para un rango de valores M(=6), utilizamos GSNAP, Ejecuta alineaciones para lecturas de extremo único y pareado  Para la muestra de G. urbanum, entre el 64.86% y el 67.74% de las lecturas de ddRAD de PE se asignaron como pares apropiados cuando permitimos de uno a nueve desajustes (M = 1–9)  PE de G. rivale que mapearon en pares apropiados aumentó gradualmente de 39.21% a 58.16% sobre M = 2 a M = 9, con un gran aumento a 79.93% para M = 10

Ensamblando radtags y llamado a SNPs  Utilizamos el canal de ref_map de STACKS (v 1.21; Catchen et al., 2011, 2013; Hohenlohe et al., 2010) para ensamblar las lecturas alineadas en etiquetas y el módulo rxstacks para corregir llamadas de genotipo basadas en información de genotipo a nivel de población usando un modelo acotado

Identificación y filtrado de parálogos.  La antigua hexaploidía complica los análisis de Geum porque las lecturas de regiones del genoma parálogas podrían mapearse en sitios idénticos  Para identificar las regiones del genoma que potencialmente atraen lecturas parálogas, utilizamos el módulo de poblaciones de STACKS  Heterocigosidad observada y el FIS en cada SNP identificado, por separado, por especie.

Análisis genético poblacional de poblaciones alopátricas.

Patrones de polimorfismo dentro y entre especies.  Caracterizamos el polimorfismo dentro y entre las especies de Geum utilizando las 12 muestras alopáricas de G. rivale y 10 muestras del Reino Unido de G. urbanum  Utilizamos el módulo de poblaciones de STACKS para identificar los SNP

Coeficientes de endogamia y diferenciación poblacional.  Aplicamos el módulo de poblaciones de STACKS para estimar los coeficientes de consanguinidad dentro de cada población (FIS) y medir la diferenciación entre poblaciones (FST) para cada especie

Identificación de SNPs de especies específicas  Utilizamos SNPs fijados alternativamente en las poblaciones alopátricas de los dos taxones, para proporcionar una lista inicial de SNPs específicos de la especie.  Para minimizar el vínculo entre los SNP de diagnóstico y obtener una estimación de la introgresión en todo el genoma, seleccionamos uno (el primero) SNP fijo alternativamente por andamio para el análisis de la introgresión

Análisis coalescente del flujo de genes durante la divergencia de linaje  Utilizamos un marco analítico de probabilidad para evaluar el soporte para modelos alternativos de divergencia entre G. rivale y G. urbanum con y sin flujo de genes  bloques cortos de secuencia : (i) sitios heterocigotos exclusivos de G. rivale, (ii) sitios heterocigotos exclusivos de G. urbanum, (iii) sitios heterocigotos compartidos por ambas especies y (iv) diferencias fijas entre las especies.

 comparamos tres modelos: (1; "div2") especies divergidas en el momento T sin introgresión, (2; "IMu>r") una historia de divergencia con el flujo de genes de G. urbanum a G. rivale y (3 ; " Imr>u") divergencia con el flujo de genes de G. rivale a G. urbanum (cuatro parámetros).  m=9  Las estimaciones de máxima probabilidad bajo cada modelo se obtuvieron en MATHEMATICA v. 10.2

Comparación genética poblacional de poblaciones alopátricas y simpátricas.

f3 pruebas de introgresión  Calculamos la estadística f3 (Patterson et al., 2012) para probar la introgresión en las poblaciones simpátricas de G. rivale o G. urbanum  f3= compara las frecuencias alélicas en dos poblaciones de origen potencial (a, b) y una población híbrida potencial (c)  Calculamos f3 como la media de (C-A) (C-B) sobre todos los SNP  Berwickshire poblaciones híbridas

Diferenciación genética entre taxones en alopatía y simpatría. Para probar si el intercambio potencial de genes dio como resultado una diferenciación reducida entre las especies en simpatría, calculamos la diferenciación genética entre las dos especies, por separado para muestras alopátricas y simpátricas Donde: P representa la frecuencia de un alelo focal en la muestra de las especies X e Y, y n es la longitud de la secuencia Teniendo en cuenta que esta diferencia en dxy entre poblaciones es análoga al estadístico D 12 muestras de alopátrica G. rivale, 20 alopátrica G. urbanum, 48 simpátricas G. rivale y 45 simpátricas G. urbanum Determinamos la media de dxy y su SE a través de los andamios

Análisis genético de híbridos e introgresión en poblaciones simpátricas.

Análisis de cluster mediante FASTSTRUCTURE  agrupamiento genotípico implementado en FASTSTRUCTURE  Nuestro análisis asumió que las muestras derivadas de dos poblaciones (es decir, K = 2)  Los datos de SNP se derivaron de un análisis STACKS de los 96 individuos genotipados con éxito  (i) los SNP se podían llamar en cualquier fracción de individuos, los cuales retenían más SNPs pero incluían valores faltantes para algunos individuos, y (ii) todos los SNP debían ser rescatables en todos los individuos.

Identificación de híbridos e individuos introgestionados utilizando SNPs específicos de la especie  scripts personalizados y los SNP específicos de la especie identificados anterior método  Tabulamos la frecuencia de los SNP que fueron heterocigotos para los alelos de diagnóstico de especies en cada individuo  nuestros análisis no especificaron una cobertura mínima porque STACKS da cuenta de la cobertura al llamar a genotipos

Análisis de la variación morfológica en poblaciones simpátricas

Medición de la variación morfológica en poblaciones simpátricas.  Desde abril de 2014, las plantas cultivadas de poblaciones simpátricas fueron monitoreadas semanalmente para la floración  ángulo en el que se sostienen las flores (grados desde la vertical) (FA), longitud del pétalo (mm), anchura del pétalo (mm), forma del pétalo (altura proporcional de la parte más ancha del pétalo), longitud del sépalo (mm), número de estambre, longitud de la estípula (mm) y anchura de la estipulación (mm)

Análisis estadístico de los datos morfológicos.  El análisis de componentes principales (PCA) se realizó en la muestra simpátrica total utilizando datos de los ocho caracteres morfológicos  Los GLM se utilizaron para probar el efecto de dos variantes de SNP, supuestamente en forma conjunta de G. rivale

Resultados

 Tde 170,030 andamios, con un N50 de 24.6 kb y un tamaño total de ensamblaje de 1.2 Gb  Se excluyeron <10 kb, quedando 32,182 andamios (con un total de longitud de 909 Mb)  Los andamios en su mayoría representan el mismo número de copias del genoma  Se busco un ensamblado genoma para 248 genes  Eucariótas ultra conservado(CEGs)  Haciendo correcciones se obtuvieron 230,356 radtags para G. rivale y G. urbanum,  Para la identificación y filtro de paralogos se uso el Raw snp  de las poblaciones alopátricas del taxón de endogamia G. urbanum.  FIS las estimaciones fueron bajas y a veces negativas, lo que Es inesperado para una especie altamente consanguínea  Se aplicó filtro de paralogía (se rechazaron 1,344 andamios con SNPs) que muestran un exceso de heterocigosidad (> 0.5) o FIS negativo) Desarrollo de marcadores SNP vía ddRAD |

Análisis genético poblacional de poblaciones alelopátricas  La mayoría de los SNP en el conjunto de datos fueron polimórficos en G. rivale (4x) pero invariante en G. urbanum

 ˃ 0.9 altas tasas de endogamia  Mill Wood muestra que se derivó de un reciente evento de outcrossing entre dos diferentes líneas puras.  En la segunda población, Selwyn Wood, solo unaSNP (polimórfico), sugiriendo que esta población puede haber sido fundada por unos pocos

Análisis coalescencia del flujo de genes durante divergencia de linaje

Comparación genética de las poblaciones alopátricas y simpatricas  Las pruebas de f3 no proporcionaron evidencia de introgresión a largo plazo desde el Reino Unido poblaciones alopátricas de Geum en G. rivale o G. urbanum Berwickshire poblaciones  La media de f3 fue negativa ( ) cuando se calculó para Berwickshire muestras G. rivale, pero no difirió significativamente desde cero (IC del 95%: a ; basado en3,945 SNPs a través de 493 andamios).  f3 para G.urbanum fue positivo ( ) no difirió significativamente desde cero (IC del 95% de a ; basado en 2,751 SNPs a través de 484 andamios).  la diferenciación genética entre G. rivale y G. urbanum es similar para muestras alopátricas y simpátricas del Reino Unido (la media de dxy (SE) es igual a y , respectivamente).

Híbridacion e introgresión en poblaciones simpatricas

Análisis de la variación morfológica en poblaciones simpatricas

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

 Nuestros análisis genómicos comparativos de poblaciones alopátricas y simpátricas de G. rivale y G. urbanum nos han permitido medir el intercambio genético histórico y contemporáneo en este par de especies  El modelado coalescente de los datos de RAD de las poblaciones alopátricas sugiere que las especies hermanas se dividen 2–3 Mya  La tasa de introgresión estimada a largo plazo es extremadamente baja  Ninguno de los análisis ealizados proporcionan evidencia de introgresión reciente significativa dentro de un área de simpatría  Por lo tanto, nuestros análisis sugieren que, a pesar de la hibridación contemporánea generalizada, la introgresión entre G. rivale y G. urbanum no ha sido importante en su evolución

 A pesar de su edad, G. rivale y G. urbanum aparentemente exhiben pocas incompatibilidades híbridas intrínsecas  Método de coalescencia ha predicho una proporción de bloques monomórficos más pequeña que la observada en el conjunto de datos  Tras la divergencia de las especies, un cambio en Ne o la introgresión puede alterar el espectro de frecuencia de emplazamiento conjunto  También encontramos poca evidencia de introgresión reciente

 No encontramos una diferenciación de especies reducida (dxy) en simpatría en comparación con alopatía, ni ninguna señal de introgresión en el análisis f3  Tanto el análisis FASTSTRUCTURE (que no se basó exclusivamente en los SNP de diagnóstico de especies) como el índice híbrido basado en los SNP de diagnóstico de especies identificaron a los mismos cuatro individuos como híbridos tempranos y retrocruzas.  Aunque nuestros resultados generales indican un intercambio genético reciente muy pequeño, un resultado intrigante proporciona evidencia tentativa de una introgresión muy limitada de G. rivale a G. urbanum.

 Dada la ausencia de evidencia de retrocruzamiento de híbridos a G. urbanum, tal introgresión solo podría surgir a través del establecimiento, después de la hibridación, de un linaje autofertilizante que comprende en gran parte material genético de G. urbanum, pero contiene esta sección del cromosoma de G. rivale.  Los bajos niveles de introgresión no son causados ​​ por la falta de oportunidades para la hibridación.  Por lo tanto, G. rivale y G. urbanum se unen a una lista creciente de especies hermanas que producen fácilmente híbridos F1 y descendientes recombinantes tempranos viables, aunque muestran poca o ninguna señal de introgresión contemporánea

 La selección ecológica contra los recombinantes se ha invocado para explicar el mantenimiento de distintas especies  Múltiples caracteres de importancia ecológica podrían ser los objetivos de selección frente a individuos recombinantes en poblaciones naturales.

GRACIAS