TIPOS DE ADN EUCARIOTAS

CONCEPTO DE GEN. TIPOS DE ADN EUCARIOTAS Segmento de ADN o ARN (Algunos virus) con información para un ¿? polipéptido o para un ARN… No es contínuo: Existen intrones y exones (10%) En virus y bacterias los genes están solapados Tipos de ADN Eucariotas con ADN espaciador: Repetitivo: Tandem: Satélites: Centrómeros y Constricción secundaria Minisatélites: Telómeros y VNTR Microsatélites: Usados como marcadores STR Disperso: LINE, SINE,LTR de HERVs (retrovirus) y Transpos No repetitivo: 37% Incluye pseudogenes,intrones, y exones (¿2%?) con sólo una o dos copias.

CONCEPTO DE GEN. TIPOS DE ADN EUCARIOTAS Hay unos 20.000 genes que codificaban proteínas, ahora se ha descubierto que hay 20.000 que producen ARN y que son responsables de factores de transcripción(¿¿8-9% + del ADN??). 80% ADN considerado antiguamente como basura tiene función reguladora de los genes anteriores (Proyecto Encode 2012)

11.1.- TIPOS DE ADN EUCARIOTAS En los eucariotas el ADN está en forma: EUCROMATINA: (ADN + Histonas):Fibra de 10-11 nm y siempre se puede transcribir. HETEROCROMATINA: No se puede transcribir: 30 nm Constitutiva: Se encuentra en todas las células y forma el ADN satélite de los centrómeros. Facultativa: Depende el estado fisiológico o del desarrollo de una célula. Diferencia las células. CROMÁTIDA: Totalmente empaquetada y es el que forma el cromosoma (que puede estar formada por una o por dos)

11.2.-INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN GENÉTICA CLONACIÓN GÉNICA TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE Conjuntos de técnicas que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Para ello debemos: Aislar un gen (gen pasajero) Introducirlo en otro ser vivo que no lo poseía o no le funcionaba bien. O en un microorganismo para clonar y traducir. ≠Clonación molecular ≠ Clon. celular ≠ Clon. Reprod.

11.2.- INGENIERÍA GENÉTICA ¿Cómo introducir un gen? Se puede realizar de forma: Directa por: Microinyección: En animales justo en el momento de la fecundación en el pronúcleo masculino Electroporación: Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el ADN, sobre la célula. Recombinación génica: ADN recombinante: ADN pasajero junto al vector transportador.

MICROINYECCIÓN Inyectar tres genes ¿? en el corazón que transformarían la cicatriz en músculo (Todd Rosengart, del Baylor College, Enero 2013). Efecto reforzante en estudios animales, si se combina con el gen VEGF [factor de crecimiento endotelial vascular]". Este gen es el responsable de la angiogénesis: creación de vasos sanguíneos: se tendría el músculo y las vías para irrigarlo.

VECTORES TRANSPORTADORES Y CÉLULAS CLONADORAS Plásmidos Cósmidos CÉLULAS CLONADORAS: Bacterias Levaduras

PLÁSMIDOS Ó EPISOMAS Son pequeñas moléculas de ADN circulares. Al insertarse: Episoma No pertenece al genoma bacteriano. El episoma SI Confiere a la bacteria características añadidas, como por ejemplo resistencia a antibióticos. Pueden ser transferidos entre bacterias. Ejemplo especial es el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, con capacidad de penetrar en células de plantas.

11.2.- INGENIERÍA GENÉTICA: VECTORES TRANSPORTADORES Cósmido: Plásmido + gen de la cápside (bacteriofago) recombinante

VECTORES TRANSPORTADORES: PLÁSMIDOS Muy aumentado Nucleoide o Genóforo

PLÁSMIDOS Ó EPISOMAS Joshua Lederberg premio nobel en 1958, junto a Beadle y Tatum. Descubrió la conjugación, la transducción y los plásmidos.

11.2.- INGENIERÍA GENÉTICA La bacteria Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido Ti, que posee los llamados genes onc. Cuando la bacteria infecta a la planta los genes onc se introducen en el ADN de la planta. Las células vegetales comienzan a crecer como si fueran cancerígenas (hormona del crecimiento). Agrobacterium se comporta , de esta forma, como un ingeniero genético natural. El científico se ha fijado en ésto y ha eliminado los genes onc y los sustituye por otros genes que interese clonar. Se consigue un sistema muy eficaz para introducir ADN interesante a la planta, al mismo tiempo que se habrá evitado la aparición de la enfermedad.

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CLONADORAS CON ADN RECOMBINANTE 1) RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS 2) PROTEINA AZUL

LEVADURAS: CLONADORES Son organismos unicelulares eucariotas Pertenecen al reino Fungi (Hongos) Son importantes en ingeniería genética por: La fermentación alcohólica. Genoma simple y conocido. Su manipulación genética es rápida y económica. Se introduce fácilmente el gen que codifica para la proteína de interés

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Son “tijeras moleculares” De forma natural se encuentran en las bacterias como medio de defensa frente a la penetración del ADN vírico. Catalizan la hidrólisis de la doble cadena de ADN en unos lugares muy específicos. Por estos lugares “cortan” y quedan unos lugares, varias bases, nitrogenadas que se denominan segmentos cohesivos La primera en descubrirse fue la Eco R1 (Arber, Smith y Nathans, premio Nóbel en 1978). El primer transgénico fue la bacteria Escherichia coli a la que le introdujeron un gen del sapo Xenopus (Berg, Cohen y Boyer, 1973).

FORMACIÓN DEL ADN RECOMBINANTE 1.- Aislamiento del gen pasajero y selección del vector transportador que tiene incorporado un identificador (chivato). 2.- Se realizan múltiples copias del gen pasajero y del vector transportador que son tratados separadamente por enzimas de restricción que cortan ambos ADN por lugares específicos o segmentos cohesivos. 3.- Las enzimas de restricción EcoR1, Bam H1 son “tijeras moleculares”. 4.- Se ponen en contacto los fragmentos de ADN pasajeros y los vectores transportadores junto al enzima ADN ligasa. Así conseguimos formar el ADN recombinante. 5.- Se introducen como plásmidos en células clonadoras

11.3.- TERAPIA GÉNICA HUMANA La terapia consiste en tratar al animal con un virus cuyo ADN ha sido modificado: sus genes virales han sido sustituidos por uno de los genes más importantes para el envejecimiento: el que codifica la enzima telomerasa. (2012)

11.3.-TERAPIA GÉNICA Transferir un gen humano normal a una bacteria para clonar y obtener: Una hormona: insulina, hormona del crecimiento. Una proteína: interferón, factor VIII de coagulación. Vacunas: Hepatitis B, Sarampión, Cólera, SIDA, rabia.. Transferir el gen correcto directamente: Angioge. Transferir a células somáticas el gen correcto, por microinyecciones o por vehículos específicos: Talasemia (problemas con las células madre). ADA (Niños burbujas) Linfocitos T. 13 casos/ 2 leuc Cáncer, hemofilia... Transferir el gen correcto a la línea germinal o al cigoto…Reproducción asistida. Producción de células madre: Desdiferenciación.

11.3.- TERAPIA GÉNICA HUMANA PRODUCTO SISTEMA DE PRODUCCIÓN INDICACIÓN TERAPÉUTICA ANTICOAGULANTES Escherichia coli Infarto de miocardio HIRUDINA Saccharomyces Prevención de trombosis INSULINA Escherichia coli / Saccharomyces Diabetes HORMONA DEL CRECIMIENTO Retraso del crecimiento y Síndrome de Turner HORMONA PARATIROIDEA Osteoporosis CALCITONINA Enfermedad de Plaget GLUCAGÓN Hipoglucemia F. HEMATOPOYÉTICOS INTERFERÓN Hepatitis B y C INTERLEUQUINA Cáncer de riñón VACUNAS: ANTIHEPATITIS A y B Prevención de hepatitis A y B

11.3.- TRATAMIENTO CONTRA EL CÁNCER Inactivar oncogenes. - Introducir genes supresores de tumores. - Introducir genes suicidas. - Introducir genes que aumenten sensibilidad a fármacos. - Introducir genes para diferenciar Célula de neuroblastoma (cáncer) transfectada con el gen de la histona metiltransferasa : recuperar la actividad de este enzima induce diferenciación glial

11.4.A.- I.G. Y PRODUCCIÓN AGRÍCOLA Plátano con gen de la pimienta resistente a bacteria putrefacción BASF abandona el cultivo de patatas transgénicas

TRANSGÉNICOS Y CÁNCER Científicos franceses han investigado durante dos años a 200 ratas de laboratorio a las que han dividido en tres grupos: las que alimentaron con el maíz transgénico NK603 en distintas proporciones (11%, 22% y 33% de su dieta), aquellas a las que además le suministraron Roundup, el herbicida al que la modificación genética las hace resistentes; y los roedores que crecieron tan solo con maíz no transgénico. Los resultados son que pasados 17 meses desde el comienzo del estudio, habían muerto cinco veces más animales masculinos alimentados con el maíz modificado genéticamente. Repetir con mejores controles y en mayor nº; la rata Dawley es muy sensible a las mutaciones. SEPT 2012

OBTENCIÓN DE MAIZ TRANSGÉNICO El gen Bt de la bacteria Bacillus thuringiensis proporciona resistencia a las plagas al producir una toxina (Bt) que produce la muerte de las larvas del taladro del maíz a las pocas horas de haberse alimentado con la planta. Se construye un plásmido recombinante con el gen pasajero codificador de la toxina Bt. Se clona miles de veces ese gen y se introduce en Agrobacterium. Se infecta esta bacteria a un cultivo de células embrionarias de máíz. Se seleccionan las células de maíz que manifiesten este gen pasajero y cada una de estas células darían lugar a una planta completa de maíz resistente a la larva del taladro

OBTENCIÓN DE MAIZ TRANSGÉNICO Bacteria

11.4.A.- I.G. Y PRODUCCIÓN AGRÍCOLA 1.- Aumento de la productividad: - Incrementos de cosechas resistentes a Tª, Salinidad, Herbicidas, insectos (Toxina Bt) y otra enfermedades microbianas - Acelerar su crecimiento. - Retraso del fruto o retraso en el deterioro: Vida comercial - Frutos mayores y mejora de la calidad nutritiva. - Menor uso de fertilizantes: Genes NIF (N2) - Incremento de la fotosíntesis añadiendo enzimas de plantas C4 2.- Transgénicos terapeúticos: Arroz dorado, patatas con vacunas contra el cólera... 3.- Genotecas: Bancos genéticos con semillas de plantas en peligro de extinción.

11.4.A.- I.G. Y PRODUCCIÓN AGRÍCOLA Vida comercial más larga: Resistencia plaga insectos Resistencia a herbicidas Mejores cualidades nutritivas

TRANSGÉNICOS AGRÍCOLAS Arroz dorado: Posee Betacarotenos de un narciso y de una bacteria. El Betacaroteno es un precursor de la Vitamina A. Deficit de Vit. A es un grave problema de salud: 3 millones niños la padecen (Sur de Asia) Previene de: diarreas, tuberculosis, malaria y de la transmisión de madres a hijos del SIDA. β-Caroteno

11.4.- I.G. Y PRODUCCIÓN AGRÍCOLA Patatas con vacunas del cólera. Soja con anticuerpos frente al virus herpex Tabaco con anticuerpos frente a caries dental producido por S. mutans Tabaco con gen resistente a sequías Tabaco moruno y biocombustibles. Naranjos resistentes al psilido El tabaco moruno junto a chumberas es invasora y útil…

11.4.B.-PRODUCCIÓN ANIMAL 1.- Obtención de órganos animales (cerdos) con genes humanos para no ser rechazados en transplantes. 2.- Aumento de la productividad y mejora nutritiva: Incrementando producción de carne, huevo o leche. Resistentes a temperaturas frías: truchas, salmones. Acelerando su crecimiento: carpas Animales con carnes y huevos con menos colesterol y grasas 3.-Transgénicos terapeúticos:Biosidus Gallinas y huevos con anticuerpos. Leche de vaca y ovejas con proteínas humanas: colágeno, fibrinógeno, GH, insulina y anticoagulantes. 4.- Bancos genéticos: Especies en peligro de ...

Cerdos transgénicos con hormonas de crecimiento Cerdos transgénicos con hormonas de crecimiento. En la foto cerdos transgénicos coloreados con genes verdes fluorescentes de medusas

ANIMALES TRANSGÉNICOS Cerdos como: Modelo de Enfermedades humanas: Alzheimer, diabetes, atrofias musculares, fibrosis… Aumento de Ω 3 Resistentes a enfermedades Cabra con gen antitrombina Ratones knockout

EJEMPLOS DE ING. GENÉTICA Bacterias biorremedadoras. Peces luciérnagas. VISUALIZA la expresión del gen (GFP) CHIVATO. Gusanos de seda con diferentes dolores de seda. Plantas antiminas Biocombustibles por levaduras. Bacterias con genoma sintético: primer ser vivo de laboratorio. Pollos que no transmiten gripe por bloqueo polimerasa M. Chalfie, R. Tsien y O. Shimomura Nobel 2008:GFP Green Fluorescent Protein producida por Hidromedusa aequorea

11.5.- PROYECTO GENOMA HUMANO Genoma: Conjunto de genes del ser humano, realizado en células sanguíneas y espermáticas. Comenzó en EEUU en 1990 y su objetivo era secuenciar completamente el ADN humano. Competencia pública-privada: Finalizó en 2000. Los datos públicos siempre eran conocidos Se compone de 3x109 pares de bases A, C, G y T. 3000 libros de 500 hojas.

11.5.- PROYECTO GENOMA HUMANO Sólo 25.000 genes: Un gen puede ser responsable de más de un polipéptido.Corresponde al 1,5% del total del genoma. Importancia del ADN “basura” como regulador (¿95%?) Sólo el 0,01% es lo que nos diferencia unos de otros. NO EXISTEN LAS RAZAS Farmacogenética: Medicamento según perfíl genético James Watson

PROYECTO GENOMA HUMANO PGH Identificar los aproximadamente 25.000 genes humanos del DNA. Determinar la secuencia de los 3.000 millones de bases nitrogenadas que conforman los nucleótidos del   DNA. Acumular la información en bases de datos Desarrollar de modo rápido y eficiente tecnologías de secuenciación, hibridación, marcadores, etc.). Desarrollar herramientas para análisis de datos. Discutir las cuestiones éticas, legales y sociales que se derivan del proyecto.

APLICACIONES DE HUELLAS GENÉTICAS VNTR Hermano Verdadero padre Al primer reconocimiento fue el hermano del padre del niño

El concepto de identificación por ADN se introdujo en 1985 por parte del genetista inglés Alec Jeffreys Encontró que ciertas regiones contiguas del ADN humano contenían secuencias repetidas (minisatélites).

Regiones que se denominan VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) Además descubrió que el número de repeticiones variaba de un individuo a otro. Individuo A: 8 veces repetido Individuo B: 3 veces repetido

HUELLAS GENÉTICAS: INVESTIGACIÓN FORENSE Secuencias de ADN repetitivo VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats) que se usan para identificar a la persona. Pueden ser: Microsatélite : secuencia de 2 a 6 pb (pares bases) , normalmente 4. Minisatelites: secuencia de unas 100 pb. ADN mitocondrial: Presenta herencia materna y es más estable que el ADN cromosómico. El cromosoma Y: Se analizan microsatélites y nucleótidos simples. Alec Jeffreys

RIESGOS DE LA I. GENÉTICA Biosanitarios: La mayoría de los productos son para consumo humano ¿Son perjudiciales? Bioético: ¿Podemos monopolizar la información genética de los seres vivos de la naturaleza? Biotecnólogico: ¿Qué ocurriría si... a) El ADN de un virus tumoral formara parte de una bacteria simbionte del cuerpo humano? b)Los genes que permiten la resistencia a los antibióticos penetrara en el genoma de las bacterias patógenas? c)Si las bacterias inocuas adquiriesen los genes de las bacterias patógenas productoras de potentes toxinas.

¿SÓLO EL GENOMA? Same Genome Different Proteome

11.6.- PROTEÓMICA Proteoma: Conjunto de proteínas que se expresan de un genoma y que varía según el estado en el que se encuentre la célula: estrés, bajo el efecto de fármacos, de una hormona, de un neurotransmisor… Proteómica: Ciencia que correlaciona las proteínas con sus genes ó el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas de un genoma. 20-25.000 genes, pero unas 100-200.000 polipéptidos

APLICACIONES PROTEÓMICA Biomarcadores de diagnóstico precoz y pronóstico de múltiples enfermedades: Cáncer, Ictus, Alzheimer, Parkinson, Epilepsia. Encontrar marcadores protéicos de: Diferenciación de especies. Desarrollo tisular y celular (Ingen. Genética) Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial farmacológico. Determinación de potencial toxicológico.

APLICACIONES PROTEÓMICA Ecológica: Conocer la interacción a nivel molecular de los organismos con su medio: adaptación y evolución. Terapia celular y génica al descubrir nuevas dianas terapéuticas (Células iPS y Factores de transcripción). Determinación de mecanismos moleculares involucrados en el origen de las enfermedades. (PATOGENIA)