PARTE II CAPÍTULO 17 METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados.

Figura 17-1. Estrategia general de secuenciación de ADN Figura 17-1. Estrategia general de secuenciación de ADN. Los métodos de secuenciación se basan en la síntesis de ADN, en cuatro reacciones en paralelo, una para cada nucleótido, a fin de producir el paro de la reacción cuando un ddNTP se añada a la reacción. Los ddNTP pueden marcarse diferencialmente con fluorocromos de diferente color. Se obtendrá la secuencia de la cadena complementaria a la cadena molde por autorradiografía o fluorescencia, leyendo de abajo hacia arriba (5’ → 3’). CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 17-2. Método de secuenciación químico de Maxam-Gilbert Figura 17-2. Método de secuenciación químico de Maxam-Gilbert. En la secuenciación química la última base que se va agregando a la lectura de la secuencia de cada fragmento generado indica la base que fue químicamente modificada y después eliminada del fragmento durante la reacción de rotura mediada por la piperidina, es decir, la base que se indica es la que en realidad falta. CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 17-3. Método de secuenciación “didesoxi” de Sanger Figura 17-3. Método de secuenciación “didesoxi” de Sanger. La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. La reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base, cada tubo contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP y se continúa con la polimerización incorporando los nucleótidos en sentido 5’ → 3’. Cuando se marcan con flurocromos la reacción total se puede hacer en un solo tubo, ya que el color emitido servirá para diferenciar las cadenas. CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 17-4. Método de secuenciación automatizado Figura 17-4. Método de secuenciación automatizado. Para realizarlo se obtienen fragmentos de ADN de la hebra molde de interés, se marcan los cuatro nucleótidos con fluorocromo de distinto color, se realiza el ciclo de secuenciación mediante PCR, se eliminan NTP sobrantes. Los fragmentos son sometidos a electroforesis en gel y mediante el sistema automatizado; el láser emitirá la luz que el detector interpreta diferencialmente de acuerdo con el fluorocromo que pase por el haz de luz para generar un patrón de curvas de acuerdo a la longitud de onda diferente para cada base, a fin de poder leer la secuencia obtenida. CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Figura 17-5. Microarreglos Figura 17-5. Microarreglos. Un microarreglo es una distribución ordenada de genes en una pequeña superficie, y mediante hibridación con el ADN problema se puede obtener respuesta instantánea de la actividad o expresión de múltiples genes en un solo análisis. La intensidad de fluorescencia es directamente proporcional al nivel de expresión del gen. La interpretación de los marcajes indicará un patrón de colores; así, cada punto en el soporte del microarreglo se asocia con el gen localizado según su color. CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN DEL ADN Y MICROARREGLOS McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE