Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2007-08 Inma Martín Burriel Curso PCR 2007-08

Programa: Miércoles 23 de enero (11h): Miércoles 23 de enero (15h): PCR en Tiempo Real (teoría) PCR en Tiempo Real (video) Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Curso PCR 2007-08

Programa: Jueves 24 de enero (9:30h): Protocolo experimental: Práctica Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Práctica Curso PCR 2007-08

Programa: Miércoles 23 de enero (11h): Miércoles 23 de enero (15h): PCR en Tiempo Real (teoría) PCR en Tiempo Real (video) Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Curso PCR 2007-08

PCR clásico La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial Curso PCR 2007-08

Necesidad de PCR en tiempo real Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales: Células obtenidas de microdisección por láser Pequeñas cantidades de tejido Biopsias embrionarias Especimenes de gran valor Curso PCR 2007-08

Técnicas de cuantificación Northern Blot Curso PCR 2007-08

Early expression of p53 responsive genes (24h) PCR Competitivo o PCR “Mimic” Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas GAPDH L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2007-08

Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers PCR Competitivo o PCR “Mimic” Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers Bcl-2 Tgf-b1 c-myc L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2007-08

PCR Competitivo o PCR “Mimic” Curso PCR 2007-08 Martín-Burriel et al. Toxicologic Pathology, 32:202–211, 2004

Permite observar la cinética PCR en Tiempo Real Nuevos químicos Nuevas plataformas instrumentales Detección de productos PCR en tiempo real Permite observar la cinética de la reacción Curso PCR 2007-08

Fases de la PCR Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación. Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos. Curso PCR 2007-08

Fases de la PCR Logarítmica Lineal Curso PCR 2007-08

Detección en la fase exponencial Curso PCR 2007-08

Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta Curso PCR 2007-08

PCR en Tiempo Real Toma los datos mientras se producen. Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado. Curso PCR 2007-08

Programa: Miércoles 23 de enero (11h): Miércoles 23 de enero (15h): PCR en Tiempo Real (teoría) PCR en Tiempo Real (video) Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Curso PCR 2007-08

Programa: Miércoles 23 de enero (11h): Miércoles 23 de enero (15h): PCR en Tiempo Real (teoría) PCR en Tiempo Real (video) Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Curso PCR 2007-08

Flurocromos: SYBR Green Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular. Necesaria curva de disociación. Curso PCR 2007-08

Ventajas e inconvenientes PCR con SYBR Green: Más barato Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento La especificidad viene dada únicamente por los primers No es equimolecular Se necesita realizar una curva de disociación Curso PCR 2007-08

Curva de disociación Curso PCR 2007-08

Curva de disociación Curso PCR 2007-08

Curva de disociación Muestras problema Controles negativos y sin RT Curso PCR 2007-08

Sondas TaqMan Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter: FAM, VIC. Quencher: TAMRA. Importante tªm (~70ºC). Equimolecular. Curso PCR 2007-08

Ventajas e inconvenientes PCR con Sondas TaqMan: Más caro Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar La especificidad viene dada por los primers y la sonda Es equimolecular No necesita curva de disociación Curso PCR 2007-08

Especificidad Diseño de sondas entre dos exones Curso PCR 2007-08

Equimolaridad TaqMan SYBR Green Curso PCR 2007-08

Sondas MGB NFQ: Quencher oscuro, no emite fluorescencia. Disminuye Baseline. Aumenta sensibilidad. MGB: Se une al surco pequeño. Aumenta la Tªm. Aumenta la eficiencia. MGB R NFQ Curso PCR 2007-08

Componentes de la reacción Metodología ryr-1: CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC C T Forward G Sonda 1 Sonda 2 A FAM VIC Reverse Protocolo: Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,5 1X 40X Assay Mix (Mescla de cebadores y sondas) 0,625 DNA 2 1-20 ng H2O 9,875 --- Total 25 Pre-lectura: 60ºC 1min PCR: 95ºC 10min 92ºC 15sec 60ºC 1min (x50) Post-lectura: 60ºC 1min Curso PCR 2007-08

Resultados CT CC NTC TT Curso PCR 2007-08

Programa: Miércoles 23 de enero (11h): Miércoles 23 de enero (15h): PCR en Tiempo Real (teoría) PCR en Tiempo Real (video) Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Curso PCR 2007-08

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2007-08

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2007-08

Glosario de términos Cuantificación: Absoluta: Relativa: Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). Se necesita una curva patrón absoluta. Relativa: Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). Curso PCR 2007-08

Glosario de términos Referencia: Calibrador: Señal utilizada para normalizar el experimento. Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción). Calibrador: Muestra que usamos para comparar las demás. Curso PCR 2007-08

Glosario de términos Standard (patrón): Threshold (umbral): Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Threshold (umbral): Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de DRn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR Curso PCR 2007-08

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2007-08

Curva estándar Curso PCR 2007-08

Curva estándar Curso PCR 2007-08

Curva Patrón y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA]. Relaciona cada concentración con su Ct. Propia de cada pareja de primers. La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: 100% (a=-3.32). 75% (a=-4). Aceptable:-3 ≤ -4. a> -3 contaminación por fluorescencia. Curso PCR 2007-08

Curva Patrón Correlación (R2): Nº de réplicas: Muestra: R2=1 (perfecta). R2≥0.97. Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima. Mantener el umbral entre experimentos. Nº de réplicas: Al menos 2 réplicas por muestra. Desviación estándar ≤ 0.38 Muestra: Curva absoluta: muestra de [] conocida. Diluciones 1/5. Curso PCR 2007-08

1. Cuantificación Absoluta Validación de la curva patrón: La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. Patrones: DNA plasmídico. DNA genómico. Productos PCR. Grandes oligonucleótidos comerciales. Resultado final relativo a una unidad de interés: Copias/ng de RNA Copias/g tejido, copias/ml sangre. Copias/genoma. Copias/ célula. ATENCION DENOMINADOR Curso PCR 2007-08

1. Cuantificación Absoluta Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): Productos de RT-PCR u oligonucleótidos: Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificación. DNA recombinante: Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. RNA recombinante: Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background). Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. Curso PCR 2007-08

1. Cuantificación Absoluta Puntos críticos de la curva patrón: DNA o RNA puro y muy concentrado. Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012). Estabilidad de las muestras patrón (RNA). Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa Curva patrón: Sencillez en la preparación. La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x). No hay unidades. Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa Puntos críticos de la curva patrón: Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno. Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciación Curso PCR 2007-08

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Curso PCR 2007-08

Polimorfismo de SNPs Sondas alelo-específicas. Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación. Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green. Las curvas de disociación discriminan alelos. Curso PCR 2007-08

Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +/- Curso PCR 2007-08

Ensayos +/- Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen. Adición de un control interno positivo (control de amplificación). Eliminar Falsos Negativos Curso PCR 2007-08

Programa: Jueves 24 de enero (9:30h): Protocolo experimental: Práctica Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Práctica Curso PCR 2007-08

Diseño primers Tamaño amplicon: 50-150pb %GC: 20-80% Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’ Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb) Curso PCR 2007-08

Diseño de primers y sonda (Primer express). La sonda esta entre los dos exones bax Curso PCR 2007-08

Diseño de primers Tm: 58-60ºC Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está unida y el 50% despegada Si se pega más del 50%más posibilidad de inespecificidades En tiempo real: Tª=Tm Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC Curso PCR 2007-08

Diseño de primers PCR: 60ºC [Primer F] Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC PCR: 60ºC [Primer F] Curso PCR 2007-08

Matriz de Primers Primer Forward Primer Reverse 50nM 300nM 900nM 2X Curso PCR 2007-08

Matriz de primers < Ct  > Sensibilidad > Rn  primers no limitantes Curso PCR 2007-08

Diseño de sondas Tm sonda 10ºC > Tm primers Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa GC: 20-80% Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB) Nunca puede haber G en el extremo 5’ (quencher natural) <4G continuas Procurar [C]>[G] Curso PCR 2007-08

Componentes de la reacción Matriz de sonda Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM) Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,5 1X Forward 1 900/300/50 nM Reverse Sonda 1,25 250 nM H2O 8,25 --- DNA 50 ng Total 25 Curso PCR 2007-08

Matriz de sonda < Ct  > Sensibilidad > Rn  no limitante 250 nM 200 nM 150 nM 100 nM 50 nM < Ct  > Sensibilidad > Rn  no limitante Curso PCR 2007-08

Recta patrón Gen Referencia Nos muestra la eficiencia de los primers: Curso PCR 2007-08

Recta Patrón: Gen de estudio bcl2 Curso PCR 2007-08

bax Curso PCR 2007-08

Referencia Activa Expresión génica: Muestra 1 Muestra 2 Gen problema 4 8 Control endógeno 2 16 ratio 0.5 Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. Control de la eficiencia de la extracción de RNA. Buscar referencias bibliográficas. Utilizar tres endógenos. Curso PCR 2007-08

Etapas del análisis de expresión Extracción de RNA Retrotranscripción Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia Análisis de la expresión del gen de estudio Normalización Análisis de los resultados Curso PCR 2007-08

Retrotranscripción El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima Distintas retrotranscriptasas en función del experimento: Expresión génica (MLMv o modificaciones) rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA difíciles) Primers: Random Hexamers expresión Poly(dT) Específico (la eficiencia de la RT dependerá del primer) virus Curso PCR 2007-08

Análisis de expresión CON curva patrón Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1 21.58 27.68 16.62 27.36 -1.92 0.0121 -0.42 0.38 -0.3 0.49 -0.2 0.627 Cantidad relativa Cantidad relativa T0 T7 Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciación Curso PCR 2007-08

Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de Ct Se basa en la eficiencia de los primers Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct) Q = e(menor Ct- Ct muestra) e =10-1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2 Ejemplo Curso PCR 2007-08

Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de Ct= 2-DDCt DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno. DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno. Expresión gen/ Expresión basal del gen =2-DDCt Expresión endógeno/ Expresión basal endóg Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados. Curso PCR 2007-08

2. Cuantificación Relativa PCR Múltiple: Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo. Reporter: 6-FAM y JOE. Evitar competición en la reacción: Limitar la concentración de primers del gen más abundante. Curso PCR 2007-08

Cuantificación Relativa Elección del método: Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón: Rápida optimización y validación. Utilización del método 2-DDCt : Se necesitan eficiencias de amplificación similares. No necesita curva patrón. Elimina los errores de dilución de la curva patrón. PCR Múltiple: Más puesta a punto. Mayor rapidez de análisis. Curso PCR 2007-08