Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas

Biotecnología Vegetal La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o parte de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines determinados Se utilizan las técnicas de ingeniería genética y cultivo de tejidos vegetales in vitro

Sistemas de transformación genética en plantas Planta transgénica Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus células, este DNA se expresa y confiere a la planta un carácter o unos caracteres nuevos Sistemas de transformación genética en plantas Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. - Sistemas basados en virus vegetales. Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística (micropartículas de oro o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo). - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación - Transferencia por microinyección.

¿Para qué plantas transgénicas? Rendimiento y calidad nutricional Biorreactores Estudio de procesos biológicos

Rasgos introducidos Resistencia a: insectos herbicidas virus, hongos, bacterias Retraso de senescencia, tolerancia a estrés Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos) Producción de polipéptidos de uso farmacológico.

Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de plantas Cultivo de tejidos Rescate de embriones Embriogénesis somática Organogénesis somática Producción de haploides Fusión de protoplastos Trasformación genética Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Métodos directos Métodos Indirectos

Cultivo de tejidos Factores comunes Composición general de medios de cultivo: Fuente de Carbono (azúcares) Macronutrientes (N, K, etc) Micronutrientes (Fe, Cl, etc) Vitaminas Agente gelificante (para medios sólidos) Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) Otros compuestos (ej: agentes quelantes) ambientación asepcia cultivo

Cultivo de tejidos: Rescate de embriones

Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática

Cultivo de tejidos: Organogénesis somática Propagación masiva Flores Frutales Árboles forestales Cultivo de meristemas Saneamiento de virus Rejuvenecimiento

Cultivo de tejidos: Producción de haploides

Cultivo de tejidos: Fusión de protoplastos

Transformación genética Técnicas básicas Enzimas de restricción Clonación de genes Secuenciación Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN Hibridación con anticuerpos (western blot) Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern) Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)

Transformación genética Técnicas básicas Enzimas de restricción Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas Clonación en plásmidos (vectores)

Transformación genética Técnicas básicas Secuenciación A C G T

Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación

Transformación genética Técnicas básicas Electroforesis (DNA, RNA,proteinas) southern northern western

Transformación genética Técnicas básicas Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Métodos indirectos Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes

Transformación genética:A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens Bacteria del suelo Gram (-) Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens Agallas en corona

Agrobacterium tumefaciens Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas. Las agallas son protuberancias formadas por conglomerados de células indeferenciadas El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la inducción de tumores, durante la infección se transfiere una porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de transferencia) La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA (oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).

¿Qué son los genes vir? Codifican factores esenciales para la transferencia e integración del T-DNA dentro del genoma de la planta. Están ubicados en una regíón de 35 kb del plásmido Ti fuera de la región del T-DNA. Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones. Responden a un metabolito secundario exudado por las plantas cuando se les provoca una herida (acetosiringona)

Transformación genética:A. tumefaciens Proceso de infección T-DNA y región de virulencia (Plásmiso Ti) Genes cromosómicos de virulencia (chv) 1. Reconocimiento Agrobacterium-célula vegetal 2. La liberación de compuestos fenólicos por parte de la célula vegetal (acetosiringona) 3. El gen vir A se expresa de manera constitutiva y la proteína Vir A es activada por compuestos fenólicos y activa entonces al gen Vir G 4. Que produce la activación de otros genes de la región vir 5. Las proteínas VirD1 y VirD2 actúan en forma conjunta como une endonucleasa y liberan la cadena del T-DNA 6. Luego se une la proteína VirE al T-DNA y se forma el complejo T que protege al DNA de la degradación 7. Proteínas codificadas en vir B forman un canal que posibilita la transferencia 8. Las proteínas VirD2 y Vir E2 permiten el reconocimiento molecular para el ingreso del T-DNA al núcleo y luego se produce la integración al genoma vegetal

Vectores derivados del plásmido Ti Componentes necesarios: Marcador de selección (resistencia a kanamicina) Origen de replicación (para que se replique en E.coli) Borde derecho de la secuencia T-DNA Polylinker (región de multiple clonaje) Tipos: binarios cointegrados

Transformación genética:A. tumefaciens

Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de resistencia a la kanamicina El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina (antibiótico de selección)

Agrobacterium rhizogenes Cultivo de raíces de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes En este caso se utiliza como vector de transformación la bacteria con su plásmido Ri intacto y además se introduce otro plásmido que contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA. Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea de la planta Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Métodos directos Bombardeo de partículas (biobalistica) Electroformación de Protoplasto Fibras de carburo de silicio “Whiskers” Transformación mediada por Glicol de polietileno (PEG)

Transformación genética:Biobalística

Manipulación de la expresión génica Promotores: constitutivos (35S del virus del mosaico del coliflor) tejido específicos (FBPasa - Rubiscom) inducibles Secuencias “enhancer” Intrones que estabilizan el mRNA producido Secuencia terminadora (nopalina sintasa)

Manipulación posttranscripcional Antisentido Se transfiere un gen que codifica para un RNA complementario (asRNA) al mRNA de interés. Al transcribirse ambos genes se forma un híbrido asRNA-mRNA que impide la traducción del último.

GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Tipo de gen utilizado en transgénesis Caracter que confiere a la planta Toxina de Bacillus thuringensis Proteína de la cubierta viral Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros organismos Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos bactericidas Genes cuyos productos afectan la biosíntesis de aminoácidos, o la fotosíntesis Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno, o la formación de pared celular Resistencia a Insectos Resistencia a Virus Resistencia a Hongos Resistencia a Bacterias Resistencia a Herbicidas Retraso maduración de frutos

ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (Birch, 1997) Cultivo (Fecha liberación) Nombre Compañía Caraterísticas Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en rama, largavida Tomate (1995) Zeneca Consistencia de pasta de tomate Algodón Papas Maiz (1996-97) Bollgard NewLeaf YieldGuard Monsanto Toxina deBacillus thuringiensis para resistencia insectos Soya Raps Algodón (95-96) Roundup Ready Resistencia a Glifosato (herbicida)

OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS Abeto Acelga Alfalfa Algodón Alamo Arabidopsis Arroz Arveja Camote Caña de azucar Cebada Centeno Clavel Crisantemo Espárrago Eucalyptus Frambuesa Frutilla Kiwi Lechuga Lirio Maíz Maní Manzana Maravilla Orquidea Papa Papaya Petunia Pera Pino Plátano Poroto Poroto de soya Remolacha Repollo Rosa Sorgo Tabaco Tomate Tulipán Trigo Vides Zanahoria Zapallo

MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON TRANSFORMACIÓN GENÉTICA Transformación de Plantas Biobalística o Agrobacterium Mejoramiento Genético Resistencia a Patógenos Resistencia a Herbicidas Esterilidad Sexual Calidad del Producto Roundup Listo Materna Paterna Insectos Hongos Bacterias Color Postcosecha

Glifosato Glifosato Bromoxinil

Asignacion Definicion Rescate de embriones Embriogénesis somática Organogénesis somática Producción de haploides Fusión de protoplastos Plasticidad Totipotencia Monocotiledodeas Dicotiledoneas