TOXICOS VOLÁTILES EN TOXICOLOGÍA FORENSE LUIS ALBERTO FERRARI Doctor Químico y Lic. En Ciencias Farmacéuticas Perito Químico Judicial y Profesor Titular de Toxicología y Química Forense-U.M. Representante Regional de TIAFT laferrari@unimoron.edu.ar

Tóxicos volátiles relevantes:. Gases letales: CO y HCN Tóxicos volátiles relevantes: *Gases letales: CO y HCN *Alcoholes: etílico, metílico y glicoles.

*Influencia del tipo de material combustionado ( contiene N o no ? ) FACTORES FISICOS Y QUÍMICOS INVOLUCRADOS EN LA GENERACIÓN DE ACIDO CIANHÍDRICO Y MONÓXIDO DE CARBONO EN INCENDIOS. TRATAMIENTO DE LOS DATOS ANALITICOS EN LA PREDICCIÓN DE SU ACCIÓN BIOLÓGICA. *Influencia del tipo de material combustionado ( contiene N o no ? ) *Agregado de retardantes de la ignición *Forma física en la que se halla el polímero *Recinto donde se produce la combustión ( abierto o cerrado ) *Temperaturas que produce la ignición.

Controversia: HCN vs. CO Repetto y Martinez (Night club) Elkius & Coleman: CO principal agente Montgomery: HCN no tan relevante Purser: Competencia de nitrilos en la acción del HCN, anula el efecto Alarie: CO es más responsable de los óbitos que el HCN. Zamecknic & Tam: Incendio avión ↑HCN Syminngton: HCN no es secundario Walsh et al: HCN ↑ incidencia en USA.

Monóxido de Carbono en % de saturación de carboxihemoglobina Víctima Monóxido de Carbono en % de saturación de carboxihemoglobina Ácido Cianhídrico (en mg/kg) 1 9 3.0 2 12 2.5 3 18 4.0 4 7 5 6 2.7 8 2.8 3.5 10 11 14 4.5 6.2 13 15 16 7.2 17 4.4 2.9 RESULTADOS 19 6 2.5 20 10 4.5 21 13 2.0 22 23 5 2.4 24 25 2.9 26 12 3.8 27 28 15 4.9 29 3.5 30 31 14 2.8 32 33 4.8 34 N.D 35

Análisis mediante Test de Pearson,  2 para determinar si existía relación estadística entre el HCN y el %COHb en sangre:  2 = 8.25 (2 teórico = 2.09; grados de libertad = 9, =0.05) => %COHb y concentración en sangre de HCN no son variables independientes. Se obtuvo una razón: (COHb) / (HCN)= constante

II. Evaluación de la contribución de cada tóxico por medio de índices, IL ILco = (COHb) – x x ILCN = ( HCN ) - y y Zona II Zona III

Zonas delimitadas por ILco = 0 e ILHCN = 0 Zona I: Individuos con niveles subletales de COHb y HCN en sangre. Zona II: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al HCN. Zona III: Individuos cuyo deceso se atribuye principalmente al CO. Zona IV: Individuos en los que ambos gases serían responsables del deceso.

Métodos analíticos aplicados en la actualidad: Microdifusión para ambos. GC-NP para HCN Cooximétrico para CO Gettler & Freimuth para CO

Estudio postmortem de Dietilenglicol Dietilenglicol ( DEG ) : País año Victms fatales Fuente USA 1937 105 Excipiente producto farmacéutico South Africa 1967 7 desconocido Spain 1985 5 Excipienteproducto farmacéutico India 1986 14 Glicerina Nigeria 1990 47 Bangladesh 1990-1992 51 Excipiente Farmacéutico Argentina 1992 29 Excipiente (propóleos) Haiti 1996 89 Excipiente farmacéutico Episodios de Intox.masivas Informados. Reseña del caso argentino.

Objetivos : a) Estimación de la dosis letal en episodio argentino b) Detección postmortem de DEG en órganos y su posible mecanismo de retención . c) Naturaleza de la fracción semicristalina formada en la fase pre analítica. d) Estudiar diferentes correlaciones entre los parámetros de medio interno con las dosis letales estimadas para el dietilenglicol.

Biotransformación DEG 2 EG GAld Glicolato Gliox Ca OXALATO deposición HE-Acetaldehido HEAA no deposición de cristales

Materiales y Métodos Determinación de parámetros bioquímicos ensayados: pO2, pH, Cl-, HCO3-,Na+, K+, GAP aniónico, EB. GAP anionico (mEq/L) = (Na+) + (K+) – (Cl-) – (HCO3-) Análisis Químico: Clasificación de víctimas en grupos acorde al tiempo de sobrevida Grupo I (hasta 3 d.) Grupo II (4 a 5 d.) Grupo III (6 a 21 d.) Para jarabe de propóleos: Cualitativo por NMR y GC-FID Cuantitativo por GC - FID, IS: EG. Ti=120ºC, 1 min, Grad: 15ºC/min, Tf: 200ºC. Carrier: N2, 12 cm3/min. FID 250ºC Para sangre y vísceras: Extracción directa con metanol Análisis por GC-FID Para fracción semicristalina: TLC-FID; GC-FID.

Resultados : Victima edad sexo TS DEGs DEGv terapia T.P.M. AM DR DH 1Z 59 F 21 - Y 23 ++ +++ 2 a 56 11 N 198 +++* 3Cu 62 M 5 2 4Y 60 7 54 + 5L 57 3 6Ca 9 7P 93 4 NR 8M 66 8 9G 65 6 NC 10Ga 11Cr 50 10 13 12Ru 13Ot 83 14 14 Fr 70 1 24 15Fa 36 16N 52 17Nn 53 ++* 18D 50-60 D Exhumac D* 19D 55-60 20NC 70-80 214 NC*

DEG IS RMN del jarabe

Composición de la fracción semicristalina

Estado Acido - base y DEG en sangre y víscera Grupo Victim Sex Peso (Kg) Edad (años) DEG Sang DEG viscera pH EB (MEq/L) GAP (MEq/L) Tiempo sobrev (Días) 1 M 77 70 + 7.31 -13.1 34.1 2 80 59 7.21 -12.0 32.0 3 F 76 57 -11.1 33.1 4 91 60 - 7.42 -12.5 29.0 5 75 93 NR 7.32 -11.5 30.5 6 62 7.36 -12.9 31.0 7 94 54 -9.1 31.7 8 7.24 -8.7 30.0 9 74 66 -8.9 31.5 10 86 50 7.45 -8.5 29.8 11 56 7.10 -8.0 28.6 12 89 83 7.30 27.8 13 92 -8.8 28.0 21 14 71 65 15 68

DEG (%P/V) y PG (%P/V) identificados en muestras de propóleos y estimación de dosis letal Grupo Victim DEG %P/V PG %P/V DEG (mg) si es consumido 5 ml jarabe DEG (mg) si consumido 20 ml de jarabe DEG (mg/Kg) si consume 5 ml de jarabe DEG (mg/Kg)si consume 20 ml de jarabe 1 55.0 32 2.7 11.0 0.0355 0.1421 2 50.5 42 2.5 10.1 0.0316 0.1266 3 66.5 30 3.3 13.3 0.0371 0.1746 4 46.0 31 2.3 9.2 0.0253 0.1011 5 58.0 2.9 11.6 0.0387 0.1547 6 56.5 33 2.8 11.3 0.0333 0.1333 7 59.9 34 11.8 0.0312 0.1247 8 52.0 29 2.6 10.4 0.0338 0.1351 9 53.5 25 10.7 0.0361 0.1444 10 24.0 53 1.2 4.8 0.0140 0.0558 11 54.0 10.8 0.0290 0.1161 12 38.0 43 1.7 7.6 0.0191 0.0764 13 39.0 1.9 7.8 0.0211 0.0844 14 28.5 1.4 5.7 0.0197 0.0817 15 29.0 5.8 0.0206 0.0838

Relación entre dosis de DEG y GAP aniónico para 13 de las 15 víctimas estudiadas. (r2= 0.63 y 0.78).  grupo 1,  grupo II,  grupo III

Conclusión: El DEG parece seguir una vía metabólica donde no existe ruptura de la molécula. En la Etapa de aislamiento puede generarse una fracción orgánica compleja que retendría al DEG por codisolución y/o adsorción, formando una fase mesomórfica con interacciones polares, negativizando falsamente los análisis de laboratorio. Podría ser retenido por tejidos en etapa postmortal, principalmente en aquellos órganos ricos en lípidos complejos (Ac.Grasos Libres y fosfolípidos). Las dosis letales encontradas fueron mucho menores a las consignadas en la literatura y es la dosis menor registrada hasta hoy(0.017-0.14 mg/Kg). Se verificó una buena correlación entre parámetros de medio interno. Por ejemplo para el Grupo I : mayores niveles de GAP aniónico y más bajos de EB. La correlación entre dosis estimada y GAP aniónico fue buena mostrando r2=0.63 y r2=0.78

Metanol: Investigación postmortem en una intoxicación masiva Metanol: Investigación postmortem en una intoxicación masiva. Reseña del caso que nos ocupa. Cuestiones oscuras y controvertidas: Ácido fórmico como metabolito Es el metanol buen indicador de intoxicación ? Relación de [C] entre órganos Tiempo de supervivencia de las víctimas Tipo de terapia aplicada ( hemodiálisis? )

Clasificación de las víctimas en grupos en la intoxicación por metanol Grupo 1: individuos con tratamiento y sobrevida de hasta 10 días (5 casos). Grupo 2: recibieron tratamiento y sobrevivieron hasta 3 días (4 casos). Grupo 3: no recibieron tratamiento y murieron en pocas horas (6 casos). Metodología para la determinación de metanol y ácido fórmico A. Metanol 1 ml de sangre o 1 g de víscera y carbonato de potasio, 1 ml de alcohol isopropílico (SI), en viales sellados durante 30 a 45 minutos a 60ºC. Inyección en GC-FID, columna empacada con 0.3% Carbowax 1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC. B. Acido fórmico (head space). Cromatografía gaseosa y detector FID previa transformación en metilformiato. Muestra con 250 l de ácido sulfúrico concentrado + 15 µl acetonitrilo (SI) + 15 l de metanol para convertir el ácido fórmico en formiato de metilo. Cromatógrafo Gaseoso columna Megabore DBWax de J&W, 30 m long. 0.53 mm de diámetro interno. Ti 35°C, 1 minuto y 10°C/min, hasta 100°C Tf . T inyección y detector = 150 °C. Reseña del caso de intoxicación masiva con metanol. En Argentina, en febrero y setiembre del año 1993, intoxicación masiva por ingesta de vinos en damajuanas contaminadas con alcohol metílico, agregado intencionalmente. El saldo 47 víctimas fatales y más de trescientas personas afectadas. En el trabajo se estudiaron 15 víctimas fatales debido a falta de disponibilidad de datos para el resto. La intoxicación se manifestó en forma rápida y los síntomas: oliguria (2 a 12 hs posteriores a la ingestión) a la anuria completa en 24 a 48 hs. Todos los casos mostraron acidosis metabólica. Entre las secuela: ceguera, que algunos padecen hasta hoy.

Concentración de metanol y ácido fórmico (g/L or g/Kg) en grupo 1, 2 y3 en sangre, hígado, pulmón, cerebro y riñón.

Gráfico mostrando la correlación entre a) concentración de ácido fórmico en cerebro y la concentración correspondiente en sangre (r2=0.86, n=15), b) ácido fórmico en riñón y pulmón para los .grupo 1,  grupo 2,  grupo 3. La mejor correlación de concentraciones corresponde a sangre vs cerebro, con un coeficiente de regresión lineal r2= 0.86, para las 15 muestras analizadas . Los coeficientes de correlación entre sangre y otros tejidos fueron: sangre vs hígado, con r2=0.69; sangre vs riñón, con un coeficiente r2=0.68 y sangre vs pulmón, con un coeficiente de regresión r2=0.56. La mejor correlación entre órganos fue la de pulmón vs riñón, para cada grupo con r2= 0.91, 0.84 y 0.87, para los grupos 1, 2 y 3 respectivamente. Otras relaciones entre tejidos fueron estudiadas pero no mostraron una buena

LI= (concentración de ácido fórmico en sangre/0.5) 100 La siguiente ecuación fue definida para estudiar el grado de letalidad debido al ácido fórmico en intoxicaciones por metanol, teniendo en cuenta el tiempo de sobrevida y el tipo de terapia aplicada (etílica). LI= (concentración de ácido fórmico en sangre/0.5) 100

Lapso entre muerte-tiempo de análisis Incidencia del lapso entre muerte y el análisis de metanol y ácido fórmico en 15 víctimas estudiadas, El tiempo transcurrido incide poco en la detección de ácido fórmico Víctim Lapso entre muerte-tiempo de análisis Metanol Ácido Fórmico (días ) sangre órganos   1a 3 - + 2 a 19 3 a 4 a 5 a 6 b 7 b NA 8 b 23 ND 9 b 4 10 b 11 b 12 b 2 13 b 14 b 69 c 15 b

Conclusión: El metanol no sería un buen parámetro en el pronóstico de sobrevida, principalmente cuando han transcurrido entre 36 a 48hs. No tomar el dato del informe analítico para aseverar causante del óbito en un análisis post mortem . El ácido fórmico, más bien que el metanol, resultaría el mejor analito de estudio. La concentración de ácido fórmico en sangre correlaciona bien con la concentración en cerebro (r2=0.86) e hígado (r2=0.69) y poco para sangre vs. pulmón (r2=0.56). La mejor correlación entre órganos fue hallada para pulmón vs. riñón para cada grupo definido, con r2=0.91, 0.84 y 0.87 para los grupos 1, 2 y 3 respectivamente. Esto último resultó muy importante porque, transcurridos dos o tres días de la intoxicación y con ausencia de alcohol metílico en sangre, la relación entre órganos, principalmente pulmón/ riñón, permitiría efectuar una mejor interpretación sobre el causal de óbito en estas intoxicaciones. La expresión matemática que fue definida para LI (índice de letalidad) ayuda a la interpretación del grado de toxicidad del episodio considerado y permite asociar dicho guarismo a las concentraciones de ácido fórmico en distintos órganos de las víctimas (Vg: hígado, pulmón, cerebro y riñón), teniendo en cuenta el tiempo de sobrevida y el tipo de terapia aplicada; comprobándose así que el modelo predictivo solo es válido para pacientes sometidos a terapia etílica y no a hemodiálisis. La introducción del índice de letalidad, IL, y las relaciones de concentración de ácido fórmico entre órganos permite arribar a la conclusión del causal de óbito y presenta una buena correlación con la suma de concentraciones de ácido fórmico en hígado, pulmón, cerebro y riñón (r2 = 0.80). Las concentraciones de ácido fórmico correlacionaron bien con los efectos clínicos y con la severidad del cuadro en humanos, corroborando investigaciones de Liesivuori y Savolainen (1991) efectuadas en especie animal.

Conclusión Final: Tipo de terapia aplicada y sobrevida influyen en la detección de metanol y ácido fórmico Ácido fórmico constituye el mejor indicador de la intoxicación metílica especialmente si ha transcurrido 72 horas desde la ingestión. La relación de concentración entre órganos puede facilitar la interpretación post mortem de la intoxicación El cerebro constituye un buen órgano cuando la muerte transcurre más de una semana posterior a la ingesta.