CROMATOGRAFÍA (parte II) Graciela Escandar

Cromatografía líquida líquida - líquida líquida - fase ligada intercambio iónico exclusión molecular líquida-sólida Líquida (cromatografía líquida) líquida sólida resina intercambio iónico gel poroso FM FE MÉTODO Sistemas a desarrollar

Cromatografía líquida Cromatografía de reparto fase estacionaria LÍQUIDA Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE

Cromatografía líquida cromatografía de partición o reparto CL convencional Fase ligada El líquido que constituye la FE está adsorbido sobre un soporte sólido inerte Las cadenas carbonadas que constituyen la FE están unidas por enlace covalente al soporte sólido inerte

Cromatografía L-L convencional FE (líquida) soporte inerte

Fase unida o ligada La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE Representación esquemática de partícula de silicagel Si O HO OH grupo silanol

Cromatografía líquida Fase ligada: empaque de siloxanos unión siloxano grupo silanol reactivo Si H O C 3 R Si O H Si C H 3 R Cl - HCl + unión siloxano alquil clorosilano

Cromatografía líquida Fase ligada: empaque de siloxanos Si O H O Si R 2 -2 HCl + 2 C l Si R alquil diclorosilano

Ejemplos de fases ligadas Hexil, C6 Octil, C8 Octadecil, C18 fenil Fase reversa

Ejemplo de interacción con “fase normal” H N NO2 --- enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie

SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’) Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto Fluoroalcanos < -2 Ciclohexano 0.04 Tolueno 2.4 Cloroformo 4.1 Etanol 4.3 Acetato de etilo 4.4 Metanol 5.1 Nitrometano 6.0 Etilenglicol 6.9 Agua 10.2 SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)

Cromatografía de adsorción Fase estacionaria sólida Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc. Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3

¿¿¿ Ab- o ad-sorción ??? absorción adsorción GLOP !!

Cromatografía de adsorción solvente flujo FE soluto adsorbido soluto desorbido

Cromatografía de adsorción Sílicagel H Si solvente débil analito Si O H R solvente fuerte analito solvente Alúmina O Al d+ d

SOLVENTE eO (SiO2) eO (Al2O3) Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder (e°). Fluoroalcanos 0.00 -0.25 Ciclohexano 0.01 -0.2 Tolueno 0.22 0.29 Cloroformo 0.26 0.40 Acetato de etilo 0.48 0.58 Etanol 0.70 0.88 Metanol 0.75 0.95 Etilenglicol 0.90 1.11 Agua grande grande SOLVENTE eO (SiO2) eO (Al2O3)

Cromatografía de intercambio iónico Fase estacionaria resinas de intercambio iónico Fundamento de separación: se produce intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.

Cromatografía de intercambio iónico Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte

Cromatografía de intercambio iónico Resinas de intercambio catiónico: ácido debil

Cromatografía de intercambio iónico Resinas de intercambio aniónico: base fuerte

Cromatografía de intercambio iónico Resinas de intercambio aniónico: base debil

Cromatografía de intercambio iónico El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3 )xMx+ + x H+ sólido solución sólido solución El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3+]x Ax- + x OH- sólido solución sólido solución

Diferentes empaques en Intercambio Iónico película intercambiadora: microesferas de sílica (1 - 2 mm) cubiertas con intercambiador iónico vidrio Resina pelicular 30 – 40 mm macroporos Resina macroreticular

Ejemplo de una separación por intercambio iónico mezcla de aminoácidos resina intercambiadora catiónica carga neta positiva grande carga neta positiva carga neta negativa carga neta negativa grande grupos cargados negativamente Los AA se mueven a través de la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH usado. Los AA con carga neta negativa grande eluyen 1ro

Cromatografía de exclusión molecular FE: geles porosos Hidrofílicos Hidrofóbicos Filtración en gel Permeación en gel Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.

Exclusión molecular

Exclusión molecular 102 104 106 Volumen PM Exclusión total Permeación selectiva Permeación total VM VS K = 0 K = 1 VR - VM VS K = Rta Volumen K = 0.2 K = 0.5

Cromatografía de afinidad muestra analito empaque etapa de interacción ligando unido covalentemente etapa de lavado columna regenerada etapa de elución solución con analito puro +

Aumento de la polaridad Elección del sistema cromatográfico Aumento de la polaridad no polar iónico polar no iónico PM 102 103 104 105 106 partición intercambio iónico fase reversa fase normal adsorción exclusión permeación en gel filtración en gel

Elección de la fase móvil fase móvil interactiva y fase móvil no-interactiva participación activa en la separación la FM solo transporta la muestra a través de la FE los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada reparto, adsorción, intercambio iónico CG y exclusión molecular