La sobrerregulación de VEGF durante la transdiferenciación de células mesoteliales como mecanismo responsable del alto transporte peritoneal de solutos en pacientes en DP Hospital Univ. La Princesa. Madrid Hospital Univ. La Paz. Madrid. Hospital Univ. Guadalajara Grupo de Estudios Peritoneales de Madrid IRSIN-FRIAT

Introducción La DP induce cambios en la célula mesotelial (CM) que sufre un fenómeno de transdiferenciación perdiendo progresivamente su fenotipo epitelial y adquiriendo fenotipo de célula mesenquimal. Aparecen miofibroblastos estromales αSMA+ que expresan marcadores mesoteliales lo que sugiere que proceden de la CM a través de un fenómeno de transición epitelial-mesenquimal

Cytokeratin ICAM-1

-SMA Submesotelial Mesotelial citokeratina Virch Arch 2004 -SMA Mismo paciente

Introducción La TEM ha sido demostrada “in vitro” (Yañez-Mo, NEJM 348:403-413, 2003) e “in vivo” mediante la administración de un adenovirus que activa el gen de TGFβ en el peritoneo de la rata (Peter J. Margetts J Am Soc Nephrol 16: 425-436, 2005) lo que induce el desarrollo precoz de fibrosis y neoangiogénesis

Day 4 after control virus Day 4 after infection Day 7 Day 21 Day 28 Day 4 after control virus Day 21 after PBS JASN 12:2029, 2001

Introducción El Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) está implicado en los fenómenos de neoangiogénesis y permeabilidad vascular. Aunque está demostrada la producción de VEGF por las CM in vitro, la fuente principal de VEGF en la DP y los mecanismos implicados en su regulación no están claros.

Objetivos Determinar el papel de la CM-no epitelioide (transdiferenciada) En la producción de VEGF En el desarrollo de neoangiogénesis En los cambios funcionales que conducen al fallo de UF

Pacientes 37 pacientes estables en DP Grupo control 18 DPCA y 27 DPA Edad: 25-79 años (media: 61.7 ± 14.5) Tiempo en DP: 12.6 ± 15.5 meses (rango 3-62). Diabéticos: 5 Soluciones: 29 lactato, 8 bicarbonato, (10 un intercambio/día con icodextrina) 6 con Hª de peritonitis (días de inflamación: 6.2 ± 5.54 días). 32 recibían EPO Grupo control 24 pac. en HD 15 voluntarios sanos

Métodos Aislamiento y cultivo de las CM Origen de las CM en cultivo Pacientes: CM procedentes del efluente peritoneal del intercambio nocturno Controles: Omento de sujetos sanos sometidos a cirugía abdominal (previo CI). Cultivo en medio de Earle M199 y Biogro-2 Marcadores de CM: Citokeratina, ICAM-1 y calretinina) Fenotipos de CM en cultivo Epitelial No-epitelial Transicional Fibroblastoide Se inducía EMT in vitro con TGFβ e IL-1 Los cultivos de CM no estaban contaminados con células endoteliales (F. von Willebrand negativo)

Métodos Biopsias MP: Peritoneo parietal de la pared abdominal anterior durante cirugía o durante el Tx Muestras 6 pacientes en DP con Cr-MTC>11 ml/min 6 pacientes en DP con Cr-MTC<11 ml/min 6 controles Histología e inmunohistoquímica (VEGF, citokeratinas, αSMA, FvW) Suero: Simultanea con la recogida del efluente (DP) Antes de la primera sesión de la semana (HD) Determinaciones Western Blot Analysis del lisado del cultivo de CM VEGF (ELISA): en el sobrenadante de las células a confluencia y en suero Cálculos funcionales: MTC-urea y MTC-Cr por métodos standard

Resultados

Fenotipos de CM obtenida de efluente peritoneal Se ven los distintos fenotipos obtenidos de los cultivos procedentes de efluente peritoneal Las células no-epiteliodes producen mayores cantidades de componentes de la matriz extracelular lo que refuerza el concepto de EMT de las células no-epitelioides.

Niveles de VEGF en el sobrenadante del cultivo de CM Las celulas de efluente producen mas VEGF que las de omento y los niveles máximos se obtienen con las células no-epitelioides.

Inducción de TEM y VEGF en el sobrenadante El ttº con TGFb + IL-1 para inducir EMT en las células de omento se acompaña de un progresivo incremento de la aparición de VEGF en el sobrenadante.

Fenotipo y VEGF en suero Los pacientes en DP con fenotipo no-epitelioide en el cultivo de CM tenian un mayor nivel de VEGF en suero. Y hay una correlación (r=0.6, p<0.01) entre producción de VEGF ex vivo y VEGF serico.

Niveles en suero y sobrenadante

Características basales y diferencias en los pacientes según fenotipo de CM en los cultivos procedentes de efluentes peritoneales ________________________________________________________________________ Fenotipo de la CM (n=37) Epitelioide (n=23) No-epitelioide (n=14) P ______________________________________________________________________________________ Edad (años) 62  14.5 60.6  13.8 64.3  16 NS Meses DP) 12.8  15.4 10.52  15 16.6  15.8 NS EPO (U/kg/sem) 94.6  94.8 83.9  99.1 112.3  88.1 NS Días inflamación 0.83  2.83 0.4  1.3 1.57  4.3 NS Carga de glucosa (Kg) 54.9  34.2 45.2  32.6 64.5  34.8 NS Urea-MTC (ml/min) 19.8  4.9 17.8  2.8 23.1  5.8 <0.01 Cr-MTC (ml/min) 9.3  2.7 7.94  1.65 11.46  2.6 <0.001 UF 3.86% (ml)* 640  242.3 786.2  117** 508.5  184.1 <0.05 CCr (ml/min) 4.9  3.3 5.37  3.41 4.33  3.14 NS VEGF suero (pg/ml) 544.8  489 4331.7  190. 4894.8  624.3 <0.01 VEGFsobrenad (pg/µg) 1773.6  2793. 2377  224.5 4068  3521.36 <0.001 Los pacientes con fenotipo epitelioide tenian mayores MTC de urea y ceatinina, menor UF y mayores niveles de VEGF en suero y en sobrenadante.

Correlación VEGF en sobrenadante y transporte peritoneal

VEGF en suero y transporte peritoneal

VEGF según el transporte peritoneal Si los pacientes son divididos según su transpporte peritoneral los altos transportadores tiene mayores niveles de VEGF tranto en suero como en sobreandante

Distribución del fenotipo de CM según Cr-MTc Fenotipo CM Epitelial-like No-epitelioide p Cr-MTC<11 (ml/min) 23 4 P<0.05 Cr-MTC>11 10 <0.001 N=10 P N=23 NS N=14 Total 37 El MTC se asocia al fenotipo de las células del efluente peritoneal. Ninguno de los pacientes con fenotipo epitelial tenían un MTC>11 mientras que el 71% (10/14 pacientes) con fenotipo no-epitelioide tenían un MTC>11. los 4 pacientes con fenotipo no-epiteliode y MTC<11 tenían un fenotipo trasnsicional

Correlación positiva Meses en DP y VEGF en suero (r=0.39, p<0.05) Días de inflamación peritoneal (peritonitis) y VEFG en suero (r=0.41, p<0.05)

Expresión de VEGF en biopsia peritoneal Se hicieron 6 biopsias control, 6 de altos transp y 6 de normal o bajo transporte. Los fibroblastos submesoteliales del ontrol no expresan VEGF, solo hay expresión en la superficie. Hay expresión de VEGF en los fibroblastos del submesotelio superior en los altos transportadores pero no en los controles o en los bajos. Los bajos muestran depósito de VEGF a nivel de las células endoteliales en el submesotelio inferior. Los altos mostraban citokeratina en la zona del estroma donde se aprecia VEGF. Lo que indica que el mecanismo responsable del alto transporte es debido, almenos en parte a la TEM de las CM.

Conclusiones La agresión peritoneal induce cambios en la CM que sufre un proceso de transdiferenciación, migra al submesotelio y adquiere un fenotipo fibroblastoide La celula no-epitelioide sobrerregula VEGF y se demuestran niveles elevados de VEGF en sobrenadante de los cúltivos de CM, efluente peritoneal y suero. La sobrerregulación de VEGF puede ser la responsable del fenómeno de neoangiogénesis observado en los pacientes en DP. Los cambios en el MTC-Cr están relacionados con el nivel de VEGF en sobrenadante del cultivo de CM y en menor medida con los niveles en efluente y en suero La intervención terapeútica debe ir dirigida a prevenir la TEM de la CM que está en el inicio de la fibrosis y la neoangiogénesis peritoneal.

. . . . UF Failure Peritoneal cavity Peritoneal Membrane Snail TFG Peritonitis Hemoperitoneo PD Fluids: Glucose (AGEs, GDPs) Lactate, Acid pH Epithelial to mesenchymal transition . . . . Snail E-Cadherin Cytokeratins RAGE MC released to PD Effluent TFG UF Failure Submesothelial Thickness Fibrosis ECM Synthesis αSMA-positve Myofibroblast Neo-Angiogenesis VEGF Peritoneal Membrane

Conclusión final Las células fibroblasto-like que aparecen en el submesotelio de la membrana peritoneal procedentes de la TEM de la CM pueden contribuir no solo al desarrollo de fibrosis sino también a la aparición de neoangiogénesis e incremento de la permeabilidad peritoneal a través de la sobrerregulación de VEGF.