GK-07

> sustancias solubles en agua DENATURACION de PROTEINAS Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales efecto de > Temperatura > pH > detergente > sustancias solubles en agua

Preparación de proteínas factor atención durante la preparación evitar alta temperatura, dejar en HIELO temperatura congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas efecto de dilución oxidación metales pesados crecimiento de bacterias proteasas mantener conc. > 1mg/ml incluir 0,1 – 1mM DTT en el tampon incluir 1 – 10mM EDTA en el tampon utilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelar incluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO

PURIFICACION DE PROTEINAS necesario para revelar su estructura desarrollo de inhibidores desarrollo de vacunas aislar proteínas recombinantes para vacunas - etc...

Vacuna de proteína recombinante Vacas clonadas y geneticamente modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia) Diseño de drogas Taste receptors

Estrategia de purificación de proteínas selección del tejido homogenización clarificación – precipitación solubilización y PURIFICACIÓN - captura purificación mediana pureza purificación, ultra pureza necesario test para monitorear ej. detección inmunológica o test funcional

Max Perutz, hemoglobina John Kendrew, mioglobina,

Cachalote (Physeter catodon)                                                                                        Cachalote (Physeter catodon) 17,8 kDa

Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,

Localización de los átomos

Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.

Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)  FUNCION Para obtener cristales  proteína pura

Proteína, Purificación Fraccionamiento celular Centrifugación Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH Cromatografía exclusión por tamaño Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina

Fraccionamiento celular

SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA TIPOS DE CENTRÍFUGAS MICRÓFUGA DE BAJA VELOCIDAD DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA

TIPOS DE ROTORES ROTORES FLOTANTES centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES ROTOR VERTICAL

Centrifugación diferencial: ROTORES FLOTANTES Centrifugación diferencial: DESPUÉS PELLET SOBRENADANTE ANTES HOMOGENEIZADO CENTRIFUGACIÓN En gradiente de densidad:

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

Fraccionamiento celular

CROMATOGRAFIA por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-) por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel por especificidad: afinidad entre proteína-proteína ej. anticuerpo

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

las proteínas con carga negativa pasan de largo Ej. intercambiador cationico proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa las proteínas con carga negativa pasan de largo

Cromatografía de Intercambio Ionico

CM-agarosa CARGA NEGATIVA carboximetil-agarosa

DEAE-columna CARGA POSITIVA Dietilaminoetil

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO Intercambio iónico - intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-) proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+) proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

Cromatografía de filtración en gel

Cromatografía de filtración en gel

DIALISIS Separación por tamaño eliminación de sal

al principio de la diálisis bolsa de diálisis solución concentrada tampón en equilibrio al principio de la diálisis

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Cromatografía de Afinidad

Proteína retenido por interacción con ligando Elusión por adición de exceso de ligando

Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación

- Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico ELECTROFORESIS electro-foresis; del griego, estar llevado Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno Las proteínas se separan por - carga eléctrica - tamaño y forma

( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro) el  -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox ( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro) A2 b-mercaptoetanol HS S S + SH A1 A1 A2 El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada negativamente

El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el desplegamiento de las mismas SDS SH – La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)

única conexión eléctrica vía el gel CÁTODO Fuente de poder reservorio de tampón superior e inferior única conexión eléctrica vía el gel Electrodo de platinum + ÁNODO electrodo de platinum

SDS-PAGE condiciones denaturantes fraccionamiento por tamaño comparación con estándar de tamaño molecular

Proteína purificada

Determinación de la secuencia de proteínas ESTRUCTURA PRIMARIA - composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC - determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres - secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente

Pero: proteínas > 100 aa - fragmentar - secuenciar péptidos - ordenar secuencia

Punto de ruptura Tratamiento tripsina quimotripsina proteasa V8 bromuro de cianogeno (CNBr) Lys, Arg Phe, Trp, Tyr Asp, Glu Met O H O R2 - C – C – N – C – C – N – C – C – N - R1 H O R3 H cortan el enlace peptídico

péptidos secuenciados Ej. tratamiento péptidos secuenciados Tyr-Lys Glu-Met-Leu-Gly-Arg Pro-Met-Arg Met-Gly-Cys-Lys hidrólisis con tripsina Leu-Gly-Arg-Met Tyr-Lys-Glu-Met Gly-Cys-Lys-Pro-Met + amino acido básico hidrólisis con CNBr SECUENCIA deducida: fragmentos con tripsina Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg fragmentos con CNBr