EQUIPO DOCENTE Prof. Responsable: Dra. Irma Gladis Rezza de Acosta Prof. Colaborador: Dra. Ana Cecilia Anzulovich Responsable de los Trabajos Prácticos: Dra. Alicia susana Molina Colaborador de TP: Dra. Mariela Coria y Dra. Lorena Navigatore

QUIMICA BIOLOGICA Objetivos: Comprender las transformaciones energéticas celulares Establecer los principios de la bioenergética Discriminar las rutas metabólicas de biosíntesis Moléculas Biológicas - Estructura química Interacciones entre moléculas Degradación y síntesis celular de las moléculas Conservación y utilización de la energía en las células Mecanismos regulatorios

BOLILLA 1 ENZIMAS: Naturaleza Química- Propiedades Generales- Evolución. Nomenclatura y Clasificación- Coenzimas y Grupos Prostéticos. Actividad Enzimática: Unidad de enzima- Actividad específica- Actividad molecular Conceptos de afinidad y cooperatividad enzimática Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH – T- [S] actividad de agua. Inhibidores naturales de la actividad enzimática Mecanismo de regulación metabólica: Inhibición y activación por sustrato, niveles enzimáticos, modulación de la actividad de enzimas Regulación Enzimática: Enzimas alostéricas (propiedades y cinética)- Zimógenos- Modulación Covalente Isoenzimas: Propiedades e importancia. Homologos de enzimas

UN POCO DE HISTORIA Jacob Berzelius, 1835(diastasa) Eduard Buchner 1897 (levaduras) James Sumner 1926 (ureasa) John Northrop y Moses Kunitz-1930 (pepsina,trip.y quimot) Ultimos 50 años (estructura y función) 1963- 1º Secuencia de aminoácidos ribonucleasa pancreatica bovina A 1965, 1º estructura Rx- Lisozima de clara de huevo de gallina 1983.Sidney Altman y Col El RNA de la ribonucleasa P tiene actividad catalítica.

Ningún organismo puede vivir sin ENZIMAS La mayoría de las reacciones deben ser catalizadas para que ocurran en el tiempo y el momento que la célula lo requiere. Las enzimas deben ser sintetizadas correctamente, con las estructuras proteicas: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria si la tuviera Cualquier alteración de la síntesis de estas proteínas puede llevar a una patología

FUNCION DE LAS ENZIMAS Transformación de nutrientes simples en moléculas complejas y viceversa Extracción de energía desde combustibles por oxidación Polimerización de subunidades para formar macromoléculas, etc

Ejemplos de transformaciones mediadas por enzimas Transformación de moléculas complejas en moléculas simples y viceversa ENZIMAS PAN n (GLUCOSA) ALMIDON PAPAS ENZIMAS ARROZ (GLUCOSA)n GLUCOGENO

PANCETA ENZIMAS MONO TRIGLICERIDOS CHIZITOS GRASAS CHORIZOS ENZIMAS GLICEROL +3 AC.GRASOS TRIGLICERIDOS

NATURALEZA Y COMPORTAMIENTO DE LAS ENZIMAS La mayoría de las ENZIMAS (E) son PROTEINAS (excepción: la ribozima) Las ENZIMAS tienen la capacidad de AUMENTAR LA VELOCIDAD de las reacciones, por ello se denominan CATALIZADORES BIOLOGICOS La sustancia sobre las cuales actúan se denominan SUSTRATO (S)

DISTRIBUCION DE LAS ENZIMAS COMPARTIMENTALIZACION: Diferentes localización dentro de la célula. SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta distintos sitios catalíticos

CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS ESTRUCTURA TERCIARIA Y CUATERNARIA SITIO DE UNION AL SUSTRATO (Sitio Activo) Uniones no Covalentes: Puente de hidrógeno Hidrofóbicas Electrostáticas NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgánicos (metales) y orgánicos (Coenzimas) ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estereoespecificidad y especificidad geométrica SON REGULABLES: La síntesis de la proteína, su actividad y degradación.

ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS ALTA ESPECIFICIDAD Único sustrato Lactato Deshidrogenasa (LDH) LACTATO Grupo de sustratos ESPECIFICIDAD RELATIVA Hexoquinasas HEXOSAS glucosa, manosa y fructosa

COENZIMA HOLOENZIMA APOENZIMA COENZIMAS ENZIMA TOTAL PROTEÍNA = APOENZIMA + ENZIMA TOTAL PROTEÍNA TERMOLÁBIL NO PROTEÍNICA TERMOESTABLE Transportadores de grupos funcionales COENZIMAS Transportadores de electrones

Enzimas que requieren iones metálicos como cofactores Fe++ ó Fe+++ Citocromo oxidasa Catalasa Peroxidasa Zn++ Anhidrasa carbónica Hexoquinasa Glucosa-6-fosfatasa Piruvato quinasa Mg++ K+ Piruvato quinasa

VITAMINAS-COENZIMAS Niacina NAD, NADP Ion Hidruro (:H -) PDH GAD Riboflavina (Vit.B2) FAD, FMN Electrones SDH Tiamina (Vit. B1) PP-tiamina Aldehídos PDH, TC Acido pantoténico Coenzima A Grupos acilo Tiolasa Acido fólico TH4 Grupos monocarbonados Ser-Treon. Deshidrat. Piridoxina (B6) P-piridoxal Transferencia grupos aminos GPT AAC-DESC Acido lipoico Lipoamida Electrones y grupos acilos. PDH

AFINIDAD - COOPERATIVIDAD Para una misma enzima que actúa sobre un grupo de sustrato, la afinidad varia de acuerdo al Sustrato AFINIDAD DE LA ENZIMA POR EL SUSTRATO HOMOTROPICA POSITIVA COOPERATIVIDAD HETEROTROPICA NEGATIVA

REACCION EZIMATICA E + S E + P Sustrato Enzima Complejo ES Producto

Energía de activación de una Reacción catalizada y una reacción no catalizada REACCION NO CATALIZADA REACCION CATALIZADA

Diagrama de coordenadas de una reacción enzimática catalizada y sin catalizar P (*) DG* cat ∆G* reacción no catalizada S Energía Libre (G) Estado de transición Progreso de la reacción ES EP

- P GLUCOSA GLUCOSA-6P ATP ADP D-Glucosa Glucoquinasa

DENOMINACION DE LAS ENZIMAS NOMBRE DEL SUSTRATO O DEL PRODUCTO CON LA TERMINACION ASA: sacarasa, ureasa, amilasa ALGUNAS TIENEN NOMBRES arbitrarios ptialina salival, pepsina del jugo gástrico CADA ENZIMA TIENE UN NOMBRE ASIGNADO POR LA COMISION INTERNACIONAL DE ENZIMAS (EC 1.1.1.27) Clase - subclase - subsubclase - nº de orden Lactato 1 1 1 27 deshidrogenasa

Tipos de reacciones catalizadas por enzimas Oxido-reducción Rotura y formación de enlaces C-C Reorganizaciones internas Transferencia de grupos Reacciones de condensación

Cómo se clasifican las enzimas??? Clase - subclase - subsubclase - nº de orden Lactato 1 1 1 27 deshidrogenasa 1-OXIDORREDUCTASAS Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) 2. TRANSFERASAS Hexoquinasa (EC 2.7.1.2)

3. HIDROLASAS 4. LIASAS 5. ISOMERASAS 6. LIGASAS Carboxipeptidasa A (EC 3.4.17.1) 4. LIASAS Piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1) 5. ISOMERASAS Fumarasa ó malato isomerasa (EC 5.2.1.1) 6. LIGASAS Piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1)

mmol de S transformados mmol de S transformados/min ACTIVIDAD ENZIMATICA Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 umol de S por minuto Actividad Específica Actividad enzimática por miligramo de proteína presente en la muestra Actividad Molecular ó Numero de Recambio Moléculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima U.I.E. = mmol de S transformados min 1 katal = 6 x 107 U.I.E. Actividad específica = U.I.E. mgr de proteína Actividad molecular = Mol de enzima mmol de S transformados/min

ACTIVIDAD ESPECIFICA A B + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ D específica U.I.E. mgr de proteína = Activ. Enzimática Prot. totales Prot.Tot: ∑

Factores que afectan la actividad enzimática pH Temperatura Concentración de Enzima Concentración de Sustrato

Influencia del pH sobre la actividad enzimática

Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimo

Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimática actividad por de la temperatura T(ºC) Actividad enzimática T. óptima de temperatura provoca desnaturalización

Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad Concentración saturante de sustrato, pH y temp. constantes [E]

VARIACION DE LA VELOCIDAD DE REACCION CON LA CONCENTRACION DE SUSTRATO Vo [S] Leonor Michaelis y Maud Menten

GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA O DE LINEWEAVER-BURK Ordenada al origen = 1/Vmáx. Pendiente= Km/Vmáx Intersección c/eje x = - 1/Km

INHIBICION ENZIMATICA COMPETITIVA NO COMPETITIVA ACOMPETITIVA INHIBICION REVERSIBLE POR ENLACE COVALENTE (Análogos del estado de transición) INHIBIDOR SUICIDA DIFP Quimotripsina INHIBICION IRREVERSIBLE Penicilina Transpeptidasa Alopurinol Xantina oxidasa

Ejemplo de Inhibidor competitivo Succinato + FADH2 Fumarato + FAD+ Succinato deshidrogenasa COO- (CH2)2 COO- CH2 Succinato Malonato

INHIBICION IRREVERSIBLE . Por unión covalente del inhibidor - Acetilcolinesterasa - Quimotripsina Enzima inactivada Diisopropilfluorfosfato (DFP)

INHIBICION IRREVERSIBLE . Inhibidor suicida Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima. El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

ISOENZIMAS Diferentes formas moleculares de una misma enzima. Son sintetizadas por genes diferentes Tienen diferente composición aminoacídica por lo que pueden separarse por electroforesis. Catalizan la misma reacción, actuando sobre el mismo sustrato para dar el mismo producto

Dos isoenzimas presentan en general diferentes valores de Km y Vmáx. Se encuentran ubicadas en diferentes compartimentos de la célula ó en diferentes tejidos. Son utilizadas en clínica para determinar el origen del tejido dañado

Lactato deshidrogenasa (LDH) Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4 M > Músculo H > Corazón

Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y hexoquinasa Actividad enzimática Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l

REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ENZIMAS ALOSTERICAS REGULACION POR PROTEINAS REGULACION POR PROTEOLISIS REGULACION COVALENTE ENZIMAS INDUCIBLES REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTERICAS Enzima 1 2 3 4 Enzima 1 ENZIMA ALOSTERICA MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICAS Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio alostérico) La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente. Son homotrópicas o heterotrópicas. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA Curva Sigmoidea

Regulación de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa (ATCasa) Aspartato (mM)

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICAS Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Vía glicolítica AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó- tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE POR UNION COVALENTE DE GRUPOS (FOSFATOS , ADENILATOS, ETC.) INTERVIENEN ENZIMAS: QUINASAS, FOSFATASAS LA UNION DEL GRUPO PUEDE ACTIVAR O INHIBIR LA ENZIMA POR UN CAMBIO CONFORMACIONAL Fosforilacion Enzima Enzima Fosfoadenilacion ADP-Ribosilación

Ejemplo de regulación covalente Fosforilasa fosfatasa 2 Pi 2 H2O Fosforilasa quinasa ATP ADP Fosforilasa b P -O-CH2 CH2- O- P Fosforilasa a (menos activa) (Cadena lateral de Ser) CH2- HO HO-CH2

REGULACION POR PROTEOLISIS Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa. Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea. ZIMOGENOS

REGULACION POR PROTEINAS Modifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa. RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrógenos con las bases del DNA