Métodos microbiológicos para la enumeración e identificación de microorganismos en alimentos Microbiología de Alimentos Aldo Dueñes Acosta 199419 Asesor: Ivan Salmeron Ochoa

Métodos de Identificación Microbiana

Tinción de Gram Separar a las bacterias en dos grandes grupos. –Cristal violeta también conocido como violeta de genciana. –Safranina. –Una mezcla de alcohol-acetona 1:1. El cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriansaa el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague. La pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta. Bacilos Gram + Bacilos Gram -

Agar Macconkey Identificación de enterobacterias que hidrolizan lactosa. Positivo: color rojo. Negativo: amarillo por utilización de peptonas ( pH)

Agar Sal Manitol Agar selectivo para aislamiento de estafilococos. Alta concentración salina. Indicador sal manitol. Estafilococos coagulasa + acidifican medio (zona amarilla). Estafilococos coagulasa – (zona roja o purpura).

Agar Salmonella-Shigella Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. Inhibición Gram + por sales billiares. Colonias con centro negro, indicativo de producción H2S.

Agar Salmonella-Shigella Microorganismo Colonia Salmonella Typhimurium Transparente, centro negro Shigella Flexneri Incolora Shigella Sonnei Proteus Mirabilis E. Coli Rosadas a rojas Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas Enterococcus Faecalis Incoloras, escaso crecimiento

Prueba de Oxidasa Identificación de la enzima CitocromoC Oxidasa. Se usa un aceptor de electrones (Tetrametil-p-fenilendiamina o Reactivo de Kovacs). En la respiración hay una secuencia de enzimas hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendoun exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno. http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

Prueba de Indol Determinar la capacidad de separar indol a partir de triptófano. Formación de un complejo rojo, indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído.

Prueba Rojo Metilo. Identificación de bacterias capaces de producir ácidos fuertes de la glucosa. Uso de un indicador rojo de metilo. MO + producen ácidos manteniendo un medio de acidez. MO – producen acetilmetil carbinol neutro aumentando el nivel de pH.

Prueba de Catalasa Degradación de Peróxido de Hidrógeno por medio de la enzima Catalasa. H2O2 Catalasa H2O + O2

Prueba OF Prueba de Oxidación Fermentación. Utilizando Dos tubos con indicador azul de brotimol. Al inocularse ambos tubos, uno con tapa semi cerrada y otro se agrega aceite y se cierra completamente. El vire de color por pH indica presencia de acido.

Prueba Fermentación de Hidratos de Carbono Determinar la capacidad de un Mo para fermentar CHOs para producir ácido c/s gas. Indicador Azul de Bromitinol Indicación de producción de gas se utiliza campana Durham.

Prueba MIO Identificación Enterobacteriaceae en base a Movilidad, Actividad de Ornitina Carboxilasa y Producción de indol. Movilidad.- Entubecimiento del medio. Ortonina.- Indicador purpura de bromo cresol. Positivo: color purpura. Negativo: color amarillo. Indol.- Adición reactivo de kovacs.

Prueba TSI Diferenciación de enterobacterias en base a fermentación , con producción de gas y determinar la producción de ác. Sulfhídrico. Agar Triple a Azucar. Lactosa, Glucosa y Sacarosa. Rojo de Fenol indicador. Producción de Tiosulfato de Sodio produce un oscurecimiento.

Prueba TSI Pico alcalino, fondo ácido (R/A): MO fermenta G Pico Acido, Fondo ácido: (A/A): MO fermenta G-L Pico alcalino, fondo alcalino (R/R): MO no fermenta azúcares. Presencia de burbujas o ruptura del medio, producción de gas. Ennegrecimiento del medio, producción de ácido sulfhídrico.

Prueba LIA Diferenciar MO, especialmente, Salmonella por descarboxilación/desaminación de Lisina, y producción ác. Sulfhídrico. Indicador Purpura de Bromocresol. Amarillo cond. Ácidas. Violeta condiciones Básicas. Descaboxilación de lisina produce amina cadaverina, produce viraje purpura. Descaboxilación en medio ácido inducido por fermentación. Desaminación de lisina produce ácido alfa-ceto-carbonico, dormando color rojizo por sal de hierro y presencia de oxideno. Ac. Surfhídrico reacciona para producir sulfuro de hierro oscureciendo el medio.

Prueba LIA Descaboxilación Positiva : Pico Violeta / Fondo Violeta Negativa: Pico Violeta / Fondo Amarillo Desaminación: Pico Rojizo / Fondo Amarillo Ennegrecimiento del medio, producción de ácido sulfhídrico.

Prueba Agar citrato Identificación de bacterias mediante la utilización de citrato. Indicador Azul de bromotinol.

Prueba Urea Identificación de Mo por actividad de la enzima eureasa. Indicador rojo de fenol. Medio ácido: color amarillo Medio alcali: color rojo. Conversión de la urea a amoniaco e hidrógeno, produciendo un medio alcali.

Interpretación de Resultados.

Métodos de numeración de MO. Realiza el conteo total de microorganismos presentes en el alimento. Se considerara un indicador de las características higiénicas generales del alimento. Los microorganismos por analizar serán miembros de poblaciones diferentes. Características del medio utilizado. Condiciones de incubación.

Cuenta Placa Una muestra es pipetiado en una caja petri esteril mezclándose con un agar. Agar a temperatura de 40°, evitar shock termico. Es aceptado una cuenta de 25-250 colonias. Recomienda realizar disoluciones antes de la numeración, para obtener cuanta deseada. Para obtener mayor confianza, duplicar los resultados. X= media de colonias V= volumen d= disolución

Número más Probable Inoculación de tubos con diferentes tamaños de muestra. Se realiza con replicas (3,4,5). Por medio de tablas se determina el número máximo en un lote.

Food microbiology

Método de Tinción. Usado en la industria láctica. Teñido por redox. Toma e de los sistemas bioquimicos activos, cambiando de color. Las sustancias más usadas son: Azul de metilo. Resazurina.

Filtro por membranas Membranas porosas que retienen a las bacterias. Una vez retenidas son inoculadas en un agar para su posterior conteo.

Filtro de epifluorecencia directa Variacion del método de filtro. Usando teñidores y microscopio fluorecentes.

Microcolonias en DEFT Una variación del Filtrado de epifluorecencia, son filtradas , inoculadas e incubadas. Determina células viables únicamente. Observación por microscopio. Dependiendo del periodo de incubación seran detectados lo microorganismos. Gram – 3 hrs. Gram + 6 hrs. Coliformas, pseudomonas, staphyllococos 8 hrs. Direct Epifluorescent Filter Techniques

Cuenta colonias por Microscopio. Recuento de colonias de un agar sobre un portaobjetos, previamente inoculado y encubado.

Goteo de agar Gotear una muestra mezclada con cultivo en caja petri vacía. Realizar disoluciones y proceder con el goteo en otra caja petri.

Películas secas Dos películas plásticas juntas, una de ellas contiene el medio de cultivo y un agente gelificante soluble en agua fría. Muestra diluida se coloca entre las películas, se realiza la incubación. Las microcolonias se colorearan por la acción de tetrazolium durante la fase de teñido.

Tubos rodantes Efectivo para conteo de bacterias anaerobias. Tubos con agar fundido e inoculado a in tubo con rosca,

Bibliografía Adams M., Moss M. (2000) Food Microbiology, 2nd Edition, UK., Real Society of Chemistry. Jay J. (2000) Modern Food Microbiology, 6th Edition, USA, Aspen Publishers. Miramontes S. Manual de Laboratorio de Microbiologia General, UACH, Facultad de Ciencias Químicas. Virtual Interactive Bacterology Laboratory Michigan State University http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

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