Callogénesis en zanahoria Trabajo experimental Callogénesis en zanahoria Reguladores de crecimiento AF-5402 Arabela Vega Aguilar Noviembre 2011

Introducción George et al (2008) definen un cultivo de callos (o bien cultivo de tejidos) como el crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas.

¿por qué zanahoria? Stewart y Reinert en 1958 descubrieron embriogénesis somática a partir de tejido de zanahoria. Establecida como sistema modelo. Fenómeno reportado en más de 300 especies. Demuestra totipotencia de plantas superiores. aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos del cultivo de células.

Objetivo general Estudiar el rol de dos diferentes auxinas en el establecimiento de cultivos de callos de zanahoria (Daucus carota).

Materiales y métodos (dos protocolos distintos) Laboratorio de Biotecnología del CIA Piezas de tejido de la raíz de zanahoria. Medio de cultivo sólido. Murashige y Skoog (MS) 2 reguladores de crecimiento. AIA y 2,4 D Un par de semanas después de haber iniciado el experimento se había descartado mucho material por contaminación y ya no había una cantidad representativa para hacer la curva de crecimiento

Tejido vegetal: proceso de desinfección Zanahorias de 20cm de longitud y 4cm de diámetro. Lavar con agua y jabón en recipiente agitando. Pelar eliminando 2mm de tejido. Cortar rebanadas de 1 cm de grueso. Sumergir en etanol al 70% por 30 seg. Sumergir en NaClO al 10% por 10 min en agitación. Inicio de trabajo en cámara de flujo laminar. Lavar rebanadas 5 veces con agua destilada y estéril, agitando en Erlenmeyer por 30 seg. Mc Donald et al (1995)

Regulador de crecimiento AIA Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 1000ppm. 2,4 D Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 500ppm. Los reguladores de crecimiento en las plantas son aquellos que a muy bajas concentraciones son capaces de modificar el crecimiento y morfogénesis de la planta.

Protocolo 1 MS con 1,0 ppm de 2,4D o 1,0 ppm de AIA. 25ml de medio por frasco. Cubos de tejido del cambium de 1cm. 1 cubo de tejido por frasco. 10 repeticiones por tratamiento. Cada frasco fue pesado y etiquetado. Peso de explantes por diferencia. Mc Donald et al (1995)

4x Protocolo 2 PhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003) MS complementado con: 1ppm de 2,4D, 2ppm de 2,4D, 1ppm de AIA y 2ppm de AIA Capa uniforme y delgada de MS. Cortes región cambial, floema sec. 4 cortes por placa. 10 repeticiones por tratamiento. Cada placa fue pesada y etiquetada. Peso de explantes por diferencia. Placas con AIA en oscuridad. Protocolo 2 4x PhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003)

Cultivo de callos (ambos protocolos) 16 horas de luz por 8 horas de oscuridad, 28 °C observaciones cada 3 días, descarte de frascos contaminados, tiempo de aparición de los callos y peso semanalmente Semanalmente se pesó para

Resultados y discusión Protocolo 1 Aparición de callos 21 días después. Muchos descartes por contaminación. Cambio de balanza, posible fuente de error. Disminución en peso en todos los explantes. Aparición de tejido nuevo y coloraciones verdes, café y moradas. Desarrollo de raíz.

AIA 2,4D Contaminación deshidratación Inicios de raíz 3 posibles FUENTES de contaminación, EN EL BORDE POR CRISTALERIA, EN EL CENTRO POR MANIPULACION (EXPERIENCIA) Y SOBRE EL TEJIDO NO HAY lo que indica que la desinfección para este protocolo estuvo bien Deshidratación del tejido por tiempo y luz Inicios de raíz 2,4D

21 días de cultivo protocolo 1 AIA 2,4 D Inicios de callo normal pero tardío, se esperaba en 2 semanas aprox en 2,4D Aparición de colores principlamente en AIA Formación de clorofila

29 días en AIA Pigmentos de fotoprotección Fotoprotección

29 días en 2,4D Primera observacion de callo NORMAL Y CLARA Formación de tejido nuevo

62 días de cultivo en AIA Estrés y antocianinas Coloraciones son producidas por ESTRÉS puede ser por agotamiento del medio, condiciones de luz, temperatura, etc. Antocianinas porque existen zanahorias con esta coloración y hay documentación de aislamiento de varios tipos de antocianinas de cultivos de células de ciertas variedades de zanahoria Según genotipo, procedencia del tejido no controlada. 48 días en 2ndo protocolo no ha aparecido Estrés y antocianinas

Raíces en AIA 2,4 induce formación de células desordenadas osea callo En ausencia de 2,4D osea la inducción de callo no ocurre se da la formación de raíces además de la pérdida de pigmentacion que se puede confundir con tejido muerto.

Resultados y discusión Protocolo 2 Semana 1 ningún cambio. Explantes con mayor superficie expuesta. Mala gelificación del medio. Presencia de azúcar: mayor contaminación. No representativo para curva de crecimiento. Muerte de tejido por desinfección. 41 días de cultivo: presencia de callo Cortes región cambial, floema sec. 41 días despues PROTOCOLO 2 y 21 días en PROTOCOLO 1

7 días en 2,4D Tejido muerto Contaminación Desinfección causó daños en el tejido. La concentración de NAClO al 10% como sugiere el protocolo es muy fuerte. Se recomiende 0.5 a 3% max. CONTAMINACIÓN SOBRE EXPLANTE

41 días de cultivo Contaminación Cambio de pigmentación Por falta de experiencia el medio de cultivo se dispensó manualmente sobre las placas y ya estaba frío, comenzó a gelificar. Posiblemente quedaron piezas con mayor cantidad de azúcar que otras lo que pudo promover el crecimiento acelerado de hongos y bacteria Distribución desuniforme. Cambio pigmenteación como reacción a la luz, clorosis.

Conclusiones y recomendaciones Reducir tiempo y concentraciones de desinfección. Definir tipo de callo (E o NE). Definir material de origen. Jiménez y Bangerth (2001) sugieren hipocótilos Narayan y Venkataraman (2000) sugieren plántulas Comparar tipos de corte para explante en iguales condiciones. Ser muy preciso con los tiempos de desinfección para evitar daños del tejido. Daños en el tejido hacen que la preparación de los explantes sea más complicada. SE UTILIZÓ MÉDULA DE RAÍZ Adempas que la ubicación ideal del cambium ya es complicada. Autores sugieren inicar callos a partir de hipocótilos o bien de plantulas

Conclusiones y recomendaciones Escoger recipiente más adecuado. Evaluar concentraciones y efecto del RC. Oscuridad evita degradación de AIA. Mejorar procedimiento de pesaje. Peso seco. Mayor número de repeticiones. Para evitar el mayor número posible de fuentes de error para elaborar curva de crecimiento, pesar explante directo con balanza dentro de cámara de flujo. Tener suficientes repeticiones mantener datos representativos.

Mi protocolo Utilizar hipocótilos como tejido de origen. Desinfección con etanol no más de 1min. Desinfección con NaClO al 3% máximo. Placas de Petri. 2,4 D a 1ppm y 2ppm, AIA a 1ppm y 2ppm Mejor manejo del medio de cultivo.

6 explantes muy pequeños por placa. Cuarto oscuro. Pesaje directo dentro de cámara. Observaciones y peso semanal. Expresar datos como % de ganancia de peso por explante, no curva de crecimiento.

Otro protocolo para zanahoria Otro protocolo: a partir de hipocótilos para inducir callos embriogénicos, mantienen en oscuridad, se transfieren cada 4 semanas, en 2,4D. CIBCM: para obtener CALLO EMBRIOGENICO en arroz el material de origen es semilla y los callos se originan del embrión con kinetina y ANA Inicio en oscuridad y aumenta condiciones de luz progresivamente embrion MADURO O INMADURO Y el callo se forma a partir de CELULAS DEL ESCUTELO , Arroz CIBCM

GRACIAS