Inmovilización orientada de anticuerpos sobre superficies inertes para su uso como biosensores Roberto Fernández-Lafuente Departamento de biocatalisis Instituto de Catálisis. CSIC. Madrid.

DETECTION OF TRACES DE ANALYTES “Design of biosensors: new protocols to achieve a direct covalent immobilization of bio-molecules (antibodies and DNA probes) on paramagnetic particles” Cell separation Immunoassay Isolation of viruses Isolation of organelles Molecular genetics Biocatalysis ??? (insoluble substrates) concentration One step begin end of analytical protocol Magnetic particles purification DETECTION OF TRACES DE ANALYTES

“New general protocols for the conjugation of biomacromolecules to magnetic microspheres” An ideal tailor-made immobilization protocol Correct orientation: Good specific biorecognization Stable attachment: Uni- o multipoint attachment Unspecific adsorption: Second antibody, target molecule, enzyme,… Spacer arms: Steric hindrances +

Conjugation of antibodies to magnetic particles Correct orientation Different immobilization protocols: Simple Universal High loading capacity Very inert surface of magnetic particles

Immobilization of Antibodies on magnetic particles Different Immobilization protocols: ●Random Immobilization through amino groups ●His- rich regions ●Sugar chains

Immobilization of Antibodies on magnetic particles: ramdon immobilization through amino groups NH2 Br NH2 Br Primary amino groups ■Terminal amino groups ■Lys NH2 Br NH2 Magnetic particles activated with Cyanogenbromide NH2 not correctly oriented ???? unstable activated supports

Immobilization of Antibodies on magnetic particles: His-rich regions NH Cu+2 COO- Highly activated magnetic particles with IDA – Cu +2 His moieties Pre-teatment of IgG not necessary Correctly oriented ???? High loading capacity Rapid and simple immobilization Mild conditions

Método estándar de inmovilización a soportes epóxido PGA 1M fosfato pH 7.0 NH2 .. pH 7.0 Adsorción física (hidrofóbica) Inmovilización covalente pH 7,8 Bloqueo con

COO - Co +2 His His COO -

Immobilization of Antibodies on magnetic particles: Sugar chains NH - NH2 ¨ + NH3 C O H Very mild oxidation of IgG Highly activated magnetic particles with controlled pK amino groups Very rapid immobilization NH3 + ¨ NH2 Correctly immobilized antibody ??? Oxidation of sugar chains present in Fc region Unaltered immunoactivity

BrCN IDA-Cu Sugar chain 25% 100% Immobilization of Antibodies on magnetic particles RESULTS Immunoactivity expressed BrCN IDA-Cu Sugar chain 25% 100% Cyanogenbromide decreases immunoactivity IDA-Cu chelates-epoxide correctly orientates and mantains immunoactivity Sugar-chain correctly orientates and mantains immunoactivity

Immobilization of Antibodies on magnetic particles Time (hours) % Immunoactivity Sugar chain IDA-Cu Unaltered inmunoactivity Better rate was achieved using sugar than IDA- Cu +2 Spacer arms: Sugar chain

Unspecific adsorption Immobilization of Antibodies on magnetic particles Primary amino groups in magnetic particles surface + Excellent ionic exchanger Approximately 70% proteins are ionically adsorbed Charged amino in magnetic particles Unspecific adsorption

Adsorción inespecífica de otras biomoléculas presentes en la muestra Inmovilización de anticuerpos a partículas magnéticas Adsorción inespecífica Soporte altamente activado muestra Analito de interés Adsorción inespecífica de otras biomoléculas presentes en la muestra Tratamiento con polímeros???

Colapso de las IgG inmovilizadas sobre superficies activadas Inmovilización de anticuerpos a partículas magnéticas Colapso de las IgG inmovilizadas sobre superficies activadas + -

+ + Superficie inerte Tratamiento con polímeros + - + - + - + - Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Superficie inerte Tratamiento con polímeros NH2 = O = O = O NH2 + NH2 = O = O = O NH3+ NH3+ COO- C O H + - NH2 + - NH2 + NH2 + - + - NH2 NH3+

Dextrano-aspártico-aldehído Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Estabilidad de los anticuerpos inmovilizados sobre nanopartículas magnéticas aminadas Dextrano-aspártico-aldehído Tampón fosfato sódico 25 mM pH 7

Immobilization of Antibodies on magnetic particles Inert surface - N C _ + NH3 + ¨ NH3 + ¨ NH3 + ¨ Primary amino magnetic particles Aspartic-aldehyde-dextran Covalent attachment Blocks positive charges Heterobifunctional polymer (different molecular weights, different percentage of carboxylic groups) A first Ionic Adsorption plus an additional covalent attachment Not significant adsorption of protein

Anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Detección de trazas de HRP con anti-HRP inmovilizandose nanopartículas magnéticas proteína diana + Incubación Anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas otras proteínas Generador campo magnético lavados Electroforesis o determinación actividad HRP (100μl)

Cantidad total HRP (mg) Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas HRP IgG Cadena pesada IgG Cadena ligera Calle1 Calle 2 Calle 3 Porcentaje de la actividad HRP inicial presente en el volumen de ensayo asociada a Anti-HRP-npm. Cantidad total HRP (mg) Volumen del ensayo (L) 0.1 0.2 0.5 1 5 10 100 0.01 0.001 90 82 75 0.0001 95 88 80

Biótica, S.L. Bacteria LIBRE Bacterias capturadas Xarxa Temàtica de Nanopartícules Magnètiques. Barcelona/Octubre 2.006 Bacteria LIBRE Bacterias capturadas en partículas IgG anti E.coli Partícula magnética

Immobilization of antibodies on magnetic particles Results Simple and controlled microspheres surface activation Correctly oriented antibody immobilized Universal and simple protocol High yield immobilization High loading binding Inert surface: Hetero-bifunctional polymer Excellent immunobiosensor 0.01 μg peroxidase in 5 liters was fully adsorbed on 1 μg of magnetic beads containing anti-peroxidase

Institute of Catalysis. CSIC. Madrid. Spain Prof. Jose Manuel Guisán Dr. Roberto Fernández-Lafuente Dr. Cesar Mateo Dr Manuel Fuentes

Institute of Catalysis. CSIC. Madrid . Spain