Métodos de observación de los microorganismos. Tinciones Diferenciales

La observación microscópica Puede efectuarse mediante un examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o bien mediante un extendido o frotis coloreado que permite observar morfología, tamaño y agrupación .

Observación en fresco El examen en fresco de una suspensión microbiana se usa para examinar muestras clínicas sin colorear, lo que evita la formación de artefactos durante la fijación y la coloración. Esta técnica permite observar: -microorganismos vivos -Ciertas funciones fisiológicas, como movilidad. -formas -tamaños -agrupaciones

Técnica 1- Colocar una gota de la muestra con el asa bacteriológica esterilizada y depositarla sobre un portaobjeto. 2-Colocar vaselina sólida en los bordes de un cubreobjeto para disminuir el secado del preparado.

3-Cubrir la gota con el cubreobjeto 3-Cubrir la gota con el cubreobjeto. Para evitar que se formen burbujas debe depositarse primero una arista y luego el resto de él. 4-Observar por medio del microscopio óptico.

Utilidad de la observación en fresco En microbiología bucal para el recuento de los microorganismos móviles/inmóviles, lo que se utiliza para establecer el estado de salud o el grado de enfermedad periodontal del paciente. Ventaja -Rapidez Desventajas -Falta de contraste

Preparación de un extendido coloreado Antes de efectuar una coloración es necesario realizar un extendido sobre la superficie de un portaobjeto, de modo que se obtenga una película delgada y uniforme. Técnica 1-Con el asa se toma una pequeña cantidad de muestra a examinar. 2-Se coloca la muestra con el portaobjeto y se la homogeniza con la gota de agua destilada estéril. 3-Se extiende la gota en el sentido del eje mayor, hasta obtener una película delgada y uniforme. 4-Se seca a temperatura ambiente o manteniéndolo a 40 cm de la llama del mechero.

Fijación Tiene como finalidad que las bacterias queden adheridas al vidrio de manera que en los sucesivos lavados realizados durante la coloración no se arrastren los gérmenes. Debe procurarse, además, que este proceso altere lo menos posible la morfología microbiana. Existen dos métodos: a-) Físico o método de Koch(calor) b-)Químico(alcohol)

Clasificación de las técnicas de tinción biológicas -Coloración de Gram -Coloración de Ziehl-Neelsen -Coloración de Giemsa

Recordemos…

Soluciones colorantes Se clasifican en básicos o catiónicos, ácidos o aniónicos y neutros ; lo que está dado por la carga electrostática de la molécula y no por los cambios de pH de la solución. Colorantes básicos: violeta de genciana, fucsina básica, cristal violeta. Colorantes ácidos: fucsina ácida, eosina. Colorantes neutros: eosinato de azul de metileno.

Coloración de Gram Es la más utilizada en el laboratorio microbiológico para la observación microscópica y permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: gram positivas y gram negativas.

Técnica Esta tinción se realiza a partir de un extendido previamente fijado con el método de Koch. 1- Cubrir la superficie del preparado con cristal violeta o violeta de genciana y dejar en contacto durante 1 minuto(colorante primario) 2-Lavar con abundante agua 3-Cubrir con lugol durante 1 minuto(mordiente) 4-Lavar con abundante agua 5-Colocar alcohol acetona hasta que el colorante deje de perder color (decolorante) 6-Lavar con abundante agua 7-Cubrir con Fucsina básica(contracolor) 8-Lavar con agua ,dejar secar y mirar al microscopio.

Fundamento La afinidad gram positiva o gram negativa de las bacterias depende de la composición y estructura química de la pared celular. Luego de aplicar el decolorante las bacterias que mantienen el color violeta se denominan gram positivas y las que lo pierden gram negativas. Esto se debe a que el alcohol acetona(decolorante) desorganiza la membrana externa de las bacterias gram negativas(constituida principalmente por lipoproteínas y lipopolisacáridos) y permite la salida del colorante primario, de modo que los microorganismos quedan desprovistos de color.

Ventajas y Utilidades -Es un método rápido y sencillo Ventajas y Utilidades -Es un método rápido y sencillo. -Permite observar la forma, el tamaño y la agrupación de microorganismos. -Permite diferenciar bacterias gram positivas de gram negativas. -Permite saber si la microbiota es mixta o monoespecífica. Desventajas -Algunas bacterias pueden no tomar la coloración de Gram -Tiñe débilmente bacterias sin pared celular.

Coloración de ziehl - neelsen Recordemos…

Es una coloración para microorganismos ácido- alcohol resistente se utiliza para diagnosticar bacterias del género Mycobacterium y algunas especies de Nocardia, Corynebacterium y Actino- mycetes. Diferencias fundamentales con la coloración de Gram. -El colorante primario(fucsina)se halla asociado a un mordiente químico(ácido fénico o carbólico), al que se le aplica un mordiente físico(calor). - La decoloración se realiza mediante la combinación de dos solventes órganicos, como el ácido y el alcohol.

Técnica Esta tinción se realiza a partir de un extendido previamente fijado con el método de Koch. 1- Cubrir el preparado con carbolfucsina(colorante primario + un primer mordiente) 2-Pasar un hisopo encendido por debajo del portaobjeto hasta llegar sólo a la emisión de vapores, durante 5 minutos (calor: mordiente físico o segundo mordiente) 3-Lavar con abundante agua 4- Colocar el ácido alcohol hasta que el preparado deje de perder color 5-Lavar con abundante agua

6-Cubrir el preparado con azul de metileno durante 1 minuto(contracolor) 7-Lavar con abundante agua 8-Dejar secar el preparado 9-Observar al microscopio con objetivos de inmersión. Fundamento Pone de manifiesto la capacidad que tienen algunas bacterias de resistir a al decoloración por ácidos y alcohol. Esta propiedad se debe al alto contenido de lípidos complejos(ácidos micólicos).

Los gérmenes que resisten la decoloración se denominan BAAR (bacterias ácido-alcohol resistente) y se ven de color rojo , mientras que los que no resisten la acción de los decolorantes se ven de color azul.

Coloración de Giemsa Resulta de la combinación de eosina y azul de metileno en una misma solución. En microbiología se utiliza para la difenciación intracelular y extracelular de parásitos en sangre circulante, en particular de especies de Plasmodium y Leishmania, formas levaduriformes de Candida, Histoplasma capsulatum.

Técnica Cubrir la superficie del extendido durante minutos con alcohol metílico(fijación química) -Cubrir el preparado con solución de Giemsa diluida y dejar actuar durante minutos. -lavar con agua -Dejar secar el preparado al aire -Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Gracias…