Ciencias y Tecnologías Químicas Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores Aplicación de enzimas en Química orgánica

Enzimas en Sintesis Orgánica Curso Posgrado 2012 Enzimas en Sintesis Orgánica 􀂉 1ª aplicación de enzimas en quimica organica : sintesis del R-Mandelonitrilo 1908 􀂉 > 13.000 referencias de la utilización de enzimas desde mediado de 1970s 􀂉 El número de aplicaciones biocataliticas crece debido a: Mas quimicos organicos aceptan el uso de biocatalizadores Aumenta el numero de nuevas enzimas que han sido identificadas Aumenta el numero de enzimas disponibles comercialmente (Fluka, Sigma, Amano, Jülich Fine Chemicals, Novozymes, Diversa, Roche,etc..) Enzimas ofrecen alta quimio-,regio- y estereoespecificidad Aumenta la demanda de compuestos opticamente puros (eg. farmacos, cosmeticos, industria alimentación) Produccion de enzimas mas facil y barato Mejora en la estabilidad enzimatica Biocatalisis reduce los pasos de reaccion comparado a sintesis organica. Biocatalisis es mas segura y Tecnologia Verde. Condiciones Suaves

Drauz, K., Waldmann, H., Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Curso Posgrado 2012 Drauz, K., Waldmann, H., Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Faber, K., Biotransformation in Organic Chemistry

Oxidoreductasas (EC1) Catalizan reacciones de oxidación y reducción Curso Posgrado 2012 Oxidoreductasas (EC1) Catalizan reacciones de oxidación y reducción 25% de todas las enzimas conocidas Dependiente de cofacor: NADH, NADPH Reciclaje del cofactor necesario Uso de celulas enteras Deshidrogenasas Oxigenasas Peroxidasas

Curso Posgrado 2012 NAD(P)+ NAD(P)H P P

Deshidrogenasas (EC 1.1.1.; EC 1.2.1., EC 1.4.1.) Curso Posgrado 2012 Deshidrogenasas (EC 1.1.1.; EC 1.2.1., EC 1.4.1.) H+ and 2 electrones son transferidos desde la unidad nicotimanida a la molecula aceptora cetona o ceto-ácido Reaccion normalmente altamente estereoselectiva Sistemas de celulas enteras (eg levadura de panaderia) Mas recientemente enzimas aisladas Necesario acoplamiento de enzima regeneradora del cofactor.

Deshidrogenasas: Síntesis de alcoholes y hidroxiacidos quirales Curso Posgrado 2012 Deshidrogenasas: Síntesis de alcoholes y hidroxiacidos quirales 􀂃 La aplicación más importante de oxidoreductasas en quimica organica 􀂃 Alcohol deshidrogenasa (ADH) en síntesis de alcoholes opticamente activos 􀂃 ADH en síntesis de ácido 3-oxo-5-hidroxi- opticamente activos 􀂃 NAD(P)H regenerado directamente desde isopropanol 􀂃 Alta estabilidad de ADH en isopropanol y acetona

Deshidrogenasas: Síntesis de aminoacidos Curso Posgrado 2012 Deshidrogenasas: Síntesis de aminoacidos Nutrición y aplicaciones médicas Otros Métodos: 􀂃 fermentación (e.g., Corynebacterium glutamicum productor de L-glutamateo, L-lisina) 􀂃extracción de hidrolisados de proteinas (e.g., L-cisteina, L-leucina, L-tirosina) 􀂃 Sintesis química: racematos 􀂃 Sintesis enzimatica: resolucion de racematos (esterasas, amidasas)

Alcohol Deshidrogenasa Curso Posgrado 2012 acetofenona Alcohol Deshidrogenasa YMR226c 100 % (S) ee>99% H2O NADPH NADP+ Acido glucónico glucosa D-glucosa Deshidrogenasa Y. Yang, Tetrahedron: Asymmetry. 2007,18,1799.

E. Garcia-Urdiales et al. Chem. Rev. 2005, 105, 313. Curso Posgrado 2012 Reducción asimétrica enzimática de cetonas NADPH NADP+ Alcohol deshidrogenasa H2O (-)-calistatina A E. Garcia-Urdiales et al. Chem. Rev. 2005, 105, 313.

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ Curso Posgrado 2012 Oxigenasas (EC 1.13.; EC 1.14.) 􀂃 monooxigenasas - introduce una molecula de oxigeno 􀂃 dioxigenases - introduce dos moleculas de oxigeno 􀂃 Alta regio y estereoselectividad 􀂃 Reacciones complejas por métodos quimicos (ej, hidrocarburos no activados) 􀂃 Limitaciones: bajos rendimientos, estabilidad RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+

Oxidación de intermedios metabólicos: lípidos, Curso Posgrado 2012 Citocromo P450 oxidasas: Oxidación de intermedios metabólicos: lípidos, hormonas esteroideas,etc.. Hemoproteinas: cofacor hemo

Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (I) Curso Posgrado 2012 Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (I) 􀂃 Building blocks para sintesis de polimeros, intermedios en sintesis de antibioticos, ingredientes de perfumes 􀂃 Hidroxilación de acidos grasos de cadena larga (C12-C18) en posición terminal (ω) y subterminal (ω-1, ω-2

Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (II) Curso Posgrado 2012 Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (II) 􀂉Síntesis de intermedios agroquímicos mediante hidroxilacion microbiana de heteroatomos (procesos LONZA) A c h r o m o b a c t e r P s e u d o m o n a s sp.

Oxigenasas: sintesis de alcoholes Curso Posgrado 2012 Oxigenasas: sintesis de alcoholes 􀂃Hidroxilación de alcanos de cadena corta (ej., propanol, (R)-2-hexanol) 􀂃 productos químicos “commodity” disponibles por biotransformación

Oxigenasas: sintesis de lactonas y esteres Curso Posgrado 2012 Oxigenasas: sintesis de lactonas y esteres 􀂃 Monooxigenasas Baeyer-Villiger- homologo biocatalitico a la oxidacion BV quimica 􀂃 Baja Estereoselectividad en BV por via química 􀂃 Alta estereoselectividad del proceso biocatalitico 􀂃 oxidación de cetonas ciclicas y no ciclicas

Curso Posgrado 2012 Peroxidasas (EC 1.11.1.-) 􀂃 Enzimas dependiente de un grupo Hemo con hierro (Fe) o Vanadio (V) 􀂃 Usan peroxido o peroxido de hidrogeno como oxidante 􀂃 reaccion natural: HCl + H2O2 HOCl + H2O (cloroperoxidasa) 􀂃 Reacciones no naturales: oxidación estereoselectiva de compuestos aromaticos NADH peroxidasa (EC 1.11.1.1), glutation peroxidasa (EC1.11.1.9) iodo peroxidasa (EC 1.11.1.8)

Peroxidasas: sintesis de alcoholes Curso Posgrado 2012 Peroxidasas: sintesis de alcoholes

Peroxidasas: sintesis de alcanos epoxidados Curso Posgrado 2012 Peroxidasas: sintesis de alcanos epoxidados

Curso Posgrado 2012 Hidrolasas (EC 3) 􀂉 Hidrolisis de enlaces C-O, C-N, C-C y otros enlaces 􀂉 Enzimas mas utilizadas en quimica organica 􀂉 No necesita cofactor 􀂉 Gran numero de enzimas disponibles comercialmente 􀂉 Reaccion reversible (esterification, amidacion, aminolisis, etc..) 􀂉 Relativa alta estabilidad bajo condiciones no naturales 􀂉 Amplio rango de sustratos Lipasas EC 3.1.1.3 Esterasas EC 3.1.1.1 Proteasas (peptidasas) EC 3.4 Amidasas and Acilasas EC 3.5

Acidos grasos glicerol Lipasas EC 3.1.1.3 Curso Posgrado 2012 Lipasas EC 3.1.1.3 􀂃 Las enzimas mas frecuentemente usadas en sintesis organica 􀂃 Funcion natural: hidrolisis de trigliceridos (aceites y grasas) 􀂃 Aplicación: detergentes lavanderia, modificacion natural de aceites y grasas, etc., sintesis de pcompuestos opticamente puros Triglicéridos Lipasa Lipasa Lipasa Diglicéridos Monoglicéridos Acidos grasos glicerol

􀂃 mecanismo de hidrolisis: Curso Posgrado 2012 Lipasas EC 3.1.1.3 􀂃 mecanismo de hidrolisis:

Lipasas: resolución de alcoholes Curso Posgrado 2012 Lipasas: resolución de alcoholes E: razon enantiomerica (calculado a partir de ee y conversion) ee: exceso enantiomerico

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Lipasas: resolución de alcoholes Curso Posgrado 2012 Lipasas: resolución de alcoholes Burkholderia cepacia BCL (anteriormente: Pseudomonas cepacia) (Fluka, Amano) Candida antarctica fraccción B (CAL-B) (Novozymes: Novozyme435®, Chirazyme®)

Lipasas: resolución de ácidos y esteres Curso Posgrado 2012 Lipasas: resolución de ácidos y esteres Candida cylindracea Proceso DSM Captoprilo

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Lipasas: combo catalisis- Resolucion cinetica dinámica Curso Posgrado 2012 Lipasas: combo catalisis- Resolucion cinetica dinámica Lipasa inmovilizada + 25ºC 100 % (R) racemización AgO 25ºC ee>99% E>100 Cproducto=100% S-B. Ko et al.J. Org. Chem. 2007, 72, 6860-6864

Lipasa Burkholderia sp.: produccion en escala muti-tonelada de aril Curso Posgrado 2012 Lipasa Burkholderia sp.: produccion en escala muti-tonelada de aril alquilaminas, alquilaminas, aminoalcoholes BASF

Esterasas EC 3.1.1.1 􀂃 Hidrolisis de esteres Curso Posgrado 2012 Esterasas EC 3.1.1.1 􀂃 Hidrolisis de esteres 􀂃 Solo algunas aplicaciones en sintesis de compuestos opticamente puros 􀂃 Moderada enantioselectividad y limitada disponibilidad comercial Esterasa de higado de cerdo (PLE) Esterasa de higado de cerdo (PLE): extraccion directa, mezcla de isoenzimas Amplia especificidad de sustrato y alta estereoselectividad

Esterasas: resolución de ácidos carboxilicos Curso Posgrado 2012 Esterasas: resolución de ácidos carboxilicos 􀂃 esterasa de Bacillus subtilis: síntesis de Naproxeno (antiinflamatorio) 􀂃 esterasa de Arthrobacter globiformis: síntesis del acido crisantemico

Proteasas EC 3.4, Amidasas y Acilasas (EC 3.5) Curso Posgrado 2012 Proteasas EC 3.4, Amidasas y Acilasas (EC 3.5) 􀂃 Hidrolisis y sintesis de enlaces amido 􀂃 Sintesis termodinamicamente controlada: desplazamiento del equilibrio en presencia de disolventes, aumento de concentracion de producto de partida, o eliminando el producto 􀂃 Sintesis cineticamente controlada: activacion del grupo carboxilo (ester o amida).

Proteasas: síntesis de péptidos Curso Posgrado 2012 Proteasas: síntesis de péptidos 􀂃 Ventajas metodo enzimatica: suave condiciones de reacción, alta regioselectividad, no racemizacion Tyr Arg Kiotorfina (analgesico) Phe Phe Asp Asp Aspartamo (x200 edulcorante) Neotame (x8000-130000 edulcorante) NutraSweet

Proteasas: síntesis de antibioticos β-lactamicos Curso Posgrado 2012 Proteasas: síntesis de antibioticos β-lactamicos Penicillina G acilasa

Fosfatasas-quinasas Tirosina PP Treonina/ serina PP Sacarosa PP ADP Curso Posgrado 2012 Fosfatasas-quinasas Desfosforilación Tirosina PP Treonina/ serina PP Fosforilación Sacarosa PP ADP ATP

Fosforilación de glicerol mediante gliceril quinasa (GQ) Curso Posgrado 2012 Fosforilación de glicerol mediante gliceril quinasa (GQ) (GQ)

Curso Posgrado 2012 Aldolasas (EC 4.1.2.13) Aldolases: liasas que catalizan adicion estereoselectiva de un donor cetona a un aceptor aldehido (condensacion aldolica). aldehido cetona enolato Mas de 30 identificadas Aldolasas tipo I: animales y plantas; activacion del donor por formacion de base de schiff como intermedio Aldolasas tipo II: bacterias y hongos y contienen un cofactor Zn2+ en el sitio activo Formación del enolato: determinante Alta tolerancia de aceptores, restringido en sustratos donores

Tipo I Tipo II Mecanismo formación de imina Catalizado ion metalico Curso Posgrado 2012 Tipo I Mecanismo formación de imina Tipo II Catalizado ion metalico

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Nomenclatura de aldolasas Curso Posgrado 2012 Nomenclatura de aldolasas

Enlace c-c, genera centro estereogénico Curso Posgrado 2012 Aldolasas Enlace c-c, genera centro estereogénico

Dos centros estereogénicos Curso Posgrado 2012 Aldolasas Dos centros estereogénicos Dos centros estereogénicos

Glicosidasas (EC 3.2.1) Alfa y beta: Endoglicosidasas (END) Curso Posgrado 2012 Glicosidasas (EC 3.2.1) Alfa y beta: Endoglicosidasas (END) Exoglicosidasas (EXO) Glicosintasas EXO END

Glicosidasas en sintesis de oligosacaridos Curso Posgrado 2012 Glicosidasas en sintesis de oligosacaridos α, β-galactosidasas

Glicosintasas en sintesis de glicoderivados Curso Posgrado 2012 Glicosintasas en sintesis de glicoderivados

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Células Cephalosporium Curso Posgrado 2012 Síntesis de Cefazolina: Uso de métodos Biocatalíticos Células Cephalosporium acremonium ATCC 48272 pH 7, 30ºC, H2O Cefalosporina C D-amino oxidasa/ Glutaril acilasa Económico Regio y Enantioselectivo Limpio Alto rendimiento pH 7, 30ºC, H2O 4 pasos Penicilina G acilasa Cefazolina

Síntesis de Cefazolina: Ruta Química Curso Posgrado 2012 Síntesis de Cefazolina: Ruta Química Ruta Química 17 pasos Cefalosporina C Woodward Premio Nobel 1965 L-cisteina Cefazolina 6 pasos 4 pasos Disolventes tóxicos -Pasos de Purificación -Bajos rendimientos 27 pasos

Semisintesis de Ecteinascidina ET-743 a partir de Metabolitos Curso Posgrado 2012 Semisintesis de Ecteinascidina ET-743 a partir de Metabolitos Escala Kg pH 7, 30ºC, H2O Pseudomonas fluorescens Cianosafracina B Fermentación Ikeda, Y. et al. J. Antibiot. 1983, 36, 1279. 20 pasos Ecteinascidina ET-743 E.J. Corey. J.Am.Chem.Soc,1996,118,9202. Síntesis Total: 32 pasos C. Cuevas y col. Org. Lett..2000, 2, 2545.

Modificación enzimática del Taxol: Mejora Biodisponibilidad Curso Posgrado 2012 Modificación enzimática del Taxol: Mejora Biodisponibilidad Termolisina acilación Lipasa C. antarctica hidrólisis Análogo 1700 veces mas soluble en agua

Síntesis enzimática de análogos de Vancomicina Curso Posgrado 2012 Síntesis enzimática de análogos de Vancomicina Vancomicina desglicosilación Diversificación química Glicosilación enzimática

Curso Posgrado 2012 Síntesis de azucares a partir de glicerina