Introducción a técnicas de ingeniería genética Oriana Salazar Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología FCFM Universidad de Chile 24 Agosto 2010

Temario Breve introducción a los métodos de DNA recombinante Métodos de ingeniería de proteínas Mutagénesis sitio Dirigido Mutagénesis al azar Estrategias de modificación genética de microorganismos Aplicación a enzimas y microorganismos usados en la producción de biocombustibles

Lípidos de membrana DNA Proteínas La célula es la unidad biológica fundamental, formada por tres tipos de macromoléculas: proteínas, lípidos y ácidos nucleicos Lípidos de membrana DNA Proteínas

Proteínas Cuatro posibles niveles de estructura: Polímeros de amino ácidos asociados en una cadena lineal. Estructura primaria (secuencia) Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria

DNA versus RNA RNA: una hebra Uracilo en lugar de timina Azúcar es ribosa, no desoxirribosa com en DNA

EL ADN es el material genético Exterior: Azúcar + fosfatos Interior: bases nitrogenadas formando puentes de Hidrógeno

Un gen es un fragmento de DNA que codifica para una proteína Expresión de los genes Un gen es un fragmento de DNA que codifica para una proteína promotor Region codificante RNA polimerasa ribosomas

Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu Traduciendo el mensaje del mRNA mRNA AGGCUUAGACCGAGU CODIGO GENETICO Proteínas Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu

Tres “letras” (nucleótidos) significan un aminoácido

La traducción del mensaje genético en el RNA se realiza a través del CÓDIGO GENÉTICO

Clonamiento de un gen

Un vector de expresión: usado para producir proteínas recombinantes Proteína recombinante Cromosoma bacteriano

Ingeniería de proteínas Modificación de la secuencia de aminoácidos de una proteína efectuados a nivel de gen (ADN) de la enzima. Gen de la enzima debe estar clonado Producción recombinante de la enzima en microorganismos

Limitaciones de las enzimas industriales Baja actividad catalítica Baja estabilidad frente a la temperatura, al pH, a los solventes del medio, etc. Especificidad de sustrato diferente a la deseada. Necesidad de efectores auxiliares de alto valor económico

Ingeniería de proteínas Los objetivos de la I.P. al modificar la secuencia de una proteína son: Alcanzar una mejor comprensión de las relaciones estructura-función Obtener un cambio deseado en alguna propiedad de la proteína

Los estudios de las relaciones estructura función permiten conocer las regiones de la estructura que son importantes para la actividad (función) de la enzima celulosa glucosa celulasa Región catalítica Región que une celulosa sustrato

Estrategias para hacer ingeniería de enzimas Estrategia racional Requiere información estructural y funcional previa (estructura). El investigador decide en base a la información disponible, qué aminoácido cambiar y por cual. Estrategia al azar o combinatorial Independiente de información previa Se generan múltiples variantes de la proteína y se selecciona la que tiene la propiedad de interés.

ESQUEMA DEL DISEÑO RACIONAL DE PROTEÍNAS ESTRUCTURA DE PROTEINAS MODELAMIENTO MOLECULAR BASADO EN ESTRUCTURA MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDO TRANSFORMACION Y EXPRESION CARACTERIZACION DE MUTANTES

Mutagénesis sitio dirigido GEN SILVESTRE GEN MUTADO TGTGTCCCAAAGTTCTATACGCTG ACACAGGGTTTCAAGATATGCGAC TGTGTCCCAGACTTCTATACGCTG ACACAGGGTCTGAAGATATGCGAC Asp PROTEINA SILVESTRE PROTEINA MUTADA

Ingeniería de proteínas por evolución dirigida

Evolución dirigida requiere del análisis masivo de miles de variantes de la enzima De una proteína de 300 aminoácidos se pueden generar 19 x 300 = 5700 variantes con un solo cambio

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