Síntesis de un Cebador Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Se requiere la síntesis de un Cebador : Las DNA polimerasas no pueden realizar la síntesis de DNA “de novo”. Requieren la existencia de un Cebador. El Cebador es una pequeña molécula de RNA complementaria del DNA. Es sintetizado por la “primasa” y tiene unos 5 nts. Forma un Complejo llamado Primosoma con la Helicasa. 5´ Primasa Helicasa 3´ 5´ 3´ Los Cebadores son sintetizados en dirección 5´ - 3´ como todas los polinucleotidos. Las Cadenas molde y nueva son antiparalelas. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Se requiere la síntesis de un Cebador : Las DNA polimerasas no pueden realizar la síntesis de DNA “de novo”. Requieren la existencia de un Cebador. El Cebador es una pequeña molécula de RNA complementaria del DNA. Es sintetizado por la “primasa” y tiene unos 5 nts. 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ Los Cebadores son sintetizados en dirección 5´ - 3´ como todas los polinucleotidos. Las Cadenas molde y nueva son antiparalelas. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Síntesis de DNA Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Hebra de Síntesis Continua Un Enzima Dimérica ( la DNA polimerasa III ) cataliza la síntesis de las nuevas cadenas utilizando como cebadores los oligonucleotidos ( RNA ). Existe una “hebra conductora” o de “síntesis continua" 5´ 3´ 5´ Hebra de Síntesis Continua 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Existe una “hebra conductora” o de “síntesis continua" Un Enzima Dimérica ( la DNA polimerasa III ) cataliza la síntesis de las nuevas cadenas utilizando como cebadores los oligonucleotidos ( RNA ). Existe una “hebra conductora” o de “síntesis continua" 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Existe una hebra Rezagada o de Síntesis discontinua Existe una hebra Rezagada o de Síntesis discontinua. También es sintetizada por la DNA Polimerasa III Hebra Rezagada o de Síntesis Discontinua 5´ 3´ 5´ Hebra Conductora o de Síntesis Continua 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Tras la acción sucesiva de la Primasa y la DNA Polimerasa III queda una cadena Continua y una cadena Rezagada constituida por fragmentos denominados Fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos aún pueden contener los cebadores. Su tamaño oscila entre 1.000 y 2000 nts. 3´ 5´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

La Replicación es Semiconservativa o Semiconservadora 5´ 3´ 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

En este esquema podemos observar el conjunto de la burbuja 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Características de la DNA Polimerasa III : Elevada capacidad catalítica : Incorpora 1.000 nts por segundo Alto grado de Fidelidad Alta Progresividad o Procesatividad : cataliza la incorporación de varios miles de nts antes de liberarse del molde. Actividad Polimerasa 5´- 3´ Actividad Exonucleasa correctora 3´- 5´ Formada por 2 grandes subunidades algo diferentes Subunidad Alfa es la DNA Polimerasa. Epsilon es la correctora. Dos subunidades Beta forman una abrazadera alrededor de cada doble cadena naciente, incrementando la procesatividad. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Actividad DNA Polimerasa en dirección 5´- 3´ La DNA Polimerasa I es un enzima que tiene tres actividades, que residen en 3 Dominios diferentes del Holoenzima : Actividad DNA Polimerasa en dirección 5´- 3´ Actividad exonucleasa 5´- 3´ que le permite hidrolizar el RNA Cebador ( actividad RNAsa H ) Actividad exonucleasa correctora 3´- 5´ Al separar el dominio exonucleasa 5´- 3´ por digestión enzimática, se obtiene el fragmento de Klenow formado por Actividad DNA Polimerasa y la actividad exonucleasa correctora 3´- 5´ La DNA Polimerasa I es poco procesativa, y su capacidad catalítica es baja, pero sin embargo repara los errores por malapareamiento de bases gracias a su actividad exonucleasa 3´- 5´. La frecuencia de error del conjunto del proceso es de 10-9 Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Melladura Melladura Actividad DNA Polimerasa en dirección 5´- 3´ Actividad exonucleasa 5´- 3´ y actividad exonucleasa correctora 3´- 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ Melladura Melladura 5´ 3´ La Polimerasa I es poco procesativa, y su capacidad catalítica es baja, pero sin embargo repara los errores por malapareamiento de bases gracias a su actividad exonucleasa 3´- 5´. La frecuencia de error del conjunto del proceso es de 10-9 Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

El cierre de las melladuras requiere de un enzima llamado Ligasa. Existen 2 tipos de DNA Ligasas : NAD+ dependientes y ATP dependientes. La DNA Ligasa de E. Coli es NAD+ dependiente 5´ 3´ OH P 5´ 3´ OH P + NAD+ AMP 5´ 3´ OH P 5´ 3´ OH P + NMN AMP 5´ 3´ O - P OH 5´ 3´ OH P Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Melladura Melladura 5´ 3´ 5´ 3´ Tras la acción de la DNA Polimerasa I ha desaparecido el RNA de los fragmentos de la hebra Rezagada, y ha sido sustituido por DNA, sin embargo la melladura se ha desplazado, pero no ha desaparecido. Se requiere de la DNA Ligasa para cerrar la Melladura. 5´ 3´ Melladura Melladura 5´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

El Lazo Deslizante 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ Avanza a lo largo de la hebra y se detiene cada 1.000 – 2.000 bp para permitir la síntesis de un Cebador, y la subsiguiente acción de la DNA Polimerasa III 5´ 3´ 3´ Dirección de avance 5´- 3´ 5´ Primosoma, DNA Polimerasa III 5´- 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid