Mapeo Genético y Genoma Humano Dra. Mildred Jiménez

Interrogantes Cantidad de genes Localización de éstos en los 24 crms Sus posiciones relativas La distancia entre ellos diagnóstico de enf consejo genético información sobre enf Inicio de la ubicación en cromosomas Estudios de largos pedigrees Transmisión del X Asociaciones con grupos sanguíneos

Mapeos Físicos y Genéticos Mapeo Físico Asigna los genes a localizaciones particulares a lo largo de los crm Usa medidas que son el reflejo de la distancia física entre genes Baja resolución: Ubica los genes según las bandas citogenéticas Alta resolución: los ubica en distancias físicas: pb

Mapeo Genético Análisis de ligamiento (Linkage), para determinar la distancia entre genes Se basa en medir la frecuencia con la cual 2 genes permanecen juntos (ligados) durante las meiosis Método completamente diferente

Mapeo Físico de Genes Humanos

Genética en Células Somáticas Estudio de la organización, expresión y regulación del gen en células cultivadas de tejidos somáticos Ventaja de poder hacer crecer diferentes células indefinidamente Permite generar clones genéticamente idénticos a una línea determinada: LINEAS CELULARES Fibroblastos (biopsias de piel) El mapeo físico de genes comprende una variedad de métodos ≠, ada uno de los cuales usa unidades diferentes de medidas y brinda diferentes grados de resolución, que van desde un cromosoma entero hasta un par de bases Tejidos somáticos: no lineas germinales Cuidados de tener medios frescos, nutrintes y no contaminación por microorganismos Permite generar clones genéticamente idénticos a una linea determinada: se puede crear una LINEA CELULAR a partir de una çeelula de un px con un desorden raro o un cariotipo anormal. Estos clones se pueden almacenar congelados o en nitrógeno líquido hasta su estudio(s) Fibroblastos tienen forma ahusada y crecen unidos superficies de plástico o vidrio y se dividen por 30-100 generaciones hasta llegr a la senescencia. Algunas lineas sufren TRANSFORMACION (≈ cancerígenas al dvidirse indefinidamente) La TRANSFORMACION puede ser espontánea o inducida por virus com el Epstein Barr. Cuidado ya que céls TRANSFORMAdas peden no guardar su neúmero euploide normal

Mapeo por transferencia de Cromosomas Método que permite transferir segmentos o cromosomas de un donador a una célula receptora cultivada. “Correlacionando qué genes están presentes en una célula receptora cuando se han transferido cromosomas específicos o segmentos particulares de crm, se puede determinar la localización cromosomal de los genes transferidos.”

Hibridización de células somáticas Forma más común de transferencia cromosómica Híbridos de células somáticas: fusión de céls somáticas de ≠ especies Hombre y ratón

Mezcla de çeels de Hombre y ratón en capas o suspención---> agentes que promueven fusión de membranas plasmáticas --> fusión de céls --->núcleos permanecen separados en el mismo citopasma Heterocariones: nucleos de los 2 tipos Homocariones: 2 nucleos de la misma especie En un medio especial se seleccionan las heterocariontes Los heterocariones sufren mitosis y meoisis y los 2 nucleos forman un solo núcleo híbrido. Con las divisiones subsecuentes se pierden crom de Ho, pero no del ratón (????) Como consecuencia de la pérdida al azar de cromosomas humanos, las difentes céls hijas contienen diferentes cantidades y combinaciones de crms humanos. Cada clon de células hibridizadas puede aislarse y analizado para estudiar del # y tipo de croms humanos que contiene, usando tecnicas de cariotipeo que distingue entre crom de ho y de ratón.

Paneles de mapeo de híbridos de células somáticas Variedad de híbridos Ho/ratón (por perdida de crms del Ho) ==> panel Se prueban los diferentes clones buscando presencia o ausencia de un gen humano y se relaciona con ausencia o presencia de un crm Ej: Tay-Sachs, gen para la hexosaminidasa A y crom 15 Se prueban los diferentes clones buscando presencia o ausencia de un gen humano y se relaciona con ausencia presencia de un crom Se mide la actividad bioquímica en caso de ue el gen se expresen en ese clon

PCR + Importante determinar si el gen que se está expresando es del ratón o del Ho. 1-PCR para amplificar ambos 2- SB con marcadores que renocan ambos y se diferencian por su tamaño.

Mapeo del gen para una región específica del cromosoma Realizar híbridos con cromosomas portadores de translocaciones o deleciones ==> gen en esa porción de cromosoma

DMD, Enf Granulomatosa crónica, Retinitis pigmentosa, Def de glicerol quinasa, hipoplasia adrenal congénita

Mapeo por irradiación de híbridos Habilidad de los rayos X de crear cortes en la doble hélice de ADN “Entre más cercanos estén dos genes entre ellos, menor es la probabilidad de que se separen por un corte por rayos X” Análisis estadístico Variaciones en dosis de rayos X Se irradian las células --> se fragmentan los crms -->se crean hídridos con los fragmentos y crms de ratón 2 genes fisicamente proximales generalmente se mantienen en el mismo híbrido, mientras que genes distantes uno del otro generalmente residen en distintos fragmentos de cromosomas y por lo tanto se encuentran en ≠ híbridos.

Mapeo por dosificación genética usando céls del px Dosis en productos de los genes que se encuentran en dosis variables: Crms 21, X… Monosomías Trisomías parciales

Mapeo por FISH Permite visualización directa de la posición del gen Regiones de 1-2 millones de pb (cromatina condensada) Los anteriores son métodos indirectos, no se puede ver la posición del gen directamente

Mapeos Genético (ligación)

Linkage “Tendencia de los alelos cercanos en un mismo cromosoma a transmitirse juntos, como una unidad intacta, durante la meiosis” Utiliza estudios familiares No requiere de FISH ni de hibridizaciones Único método que permite el mapeo de genes, incluyendo genes causantes de enf, detectables solamente como rasgos fenotípicos La mayoría de los genes generadores de enf genéticas caen estan dentro de esta categoría, ya que ni su bioquímica ni sus bases moleculares se han elucidado aún Es el único método que permite el mapeo de genes, incluyendo genes cuasantes de enf, detectables solamente como rasgos fenotípicos. La mayoría de los genes generadores de enf genéticas caen dentro de esta categoría ya que ni su bioquímica ni suus bases moleculares sehan elucidado aún.

El Análisis de ligamiento es la base del mapeo genético. Si un par de genes está localizado en el mismo cromosoma, entonces están físicamente ligados y por lo tanto se heredarán juntos. Haplotipo: grupo de alelos de loci íntimamente ligados que se encuentran en un individuo y que se heredan como una unidad. Experimentos de cruces genéticos: muy pocos pares de genes muestran un ligamiento completo, Ligamiento parcial: algunas veces se heredan juntos y otras no. Explicación: comportamiento de cromosomas durante la MEIOSIS.

Durante la meiosis I, cada cromosoma se alinea con su homólogo para formar un bivalente que contiene 4 copias (se distribuirá 1 por gameto). Dentro del bivalente, los brazos del cromosoma (las cromátidas) pueden sufrir rompimientos físicos e intercambio de segmentos de ADN. Este proceso se conoce como RECOMBINACIÓN

Recombinación Intercambio de material genético entre cromosomas durante la meiosis por la formación de enlaces físicos entre cromáticas no-hermanas (quiasmas). Cromosomas parentales en hijos nunca son exactamente iguales a los cromosomas parentales heredados: variación entre individuos. Existen puntos calientes (hot spots) de recombinación.

Del ligamiento parcial al Mapeo Dos genes que están cercanos serán separados menos frecuentemente por recombinación que dos genes lejanos entre sí (estos últimos pueden comportarse como si estuvieran en cromosomas diferentes si están lo suficientemente separados) La frecuencia con la que los genes son desligados por recombinación será directamente proporcional a la distancia que los separa en el cromosoma. La Frecuencia de Recombinación es por lo tanto una medida de la distancia entre dos genes. Construcción de Mapas a base de frecuencias de recombinación.

Si un marcador y la enfermedad se heredan juntos, la hipótesis es que están tan cerca que se heredan ligados “A menor frecuencia de recombinación, más cercanos se encuentran los loci” A- si ocurre por lo menos 1 CO en el segmento del crm entre los loci 1 y 2, aparecer´na tanto recombinantes como no recombinantes en la progenie, en los mismas %. B- Si los dos loci están muy cercanos en el mismo crm, no se va a dar CO ==> linkage completo ==>no se van a ver recombinantes (0% d erecombiantes) C- Entre los 2 explimos citados: dseparados los suficientes para que se pueda dar el CO. Se da el CO en cierta meiosis y en otras no, y %nonrecombiantes >> %recombinates

Construcción del Mapa Genes Frec. de Recombinación s w v m m Entre m y v: 3.0% v Entre m y s: 33.7% w Entre v y w: 29.4% s Entre w y s: 1.3% s w v m 0 1.3 30.7 33.7

Mapa genético Muestra el orden lineal de los genes a lo largo del cromosoma con las distancias entre genes adyacentes proporcional a la frecuencia de recombinación entre ellos. También son llamados mapas de ligamiento, mapas cromosómicos. La unidad de distancia en un mapa genético se llama Unidad de Mapa: 1% de recombinación Una unidad de mapa también es llamada Centimorgan (cM) Ejemplo: dos genes que se recombinan con una frecuencia de 3.5% están separados por 3.5 unidades de mapa, o 3.5 cM Físicamente 1 unidad de mapa se define como la longitud del cromosoma en la cual, en promedio, se forma 1 entrecruzamiento en cada 50 células que sufren meiosis.

Análisis de ligamiento: cruces dirigidos. Se basa en el análisis de la progenie de cruces experimentales realizados entre padres de genotipos conocidos. Se usan especies manejables, con ciclos de vida cortos. Determinación del genotipo de gametos es posible pero laborioso y altamente complejo. Se utilizan los cruces de prueba. Doble heterocigota x doble homocigota: AaBb x AAbb

Análisis de ligamiento: análisis de genealogías. En humanos no se pueden hacer cruces dirigidos. Estudio de genealogías que presentan alguna enfermedad (fenotipo diferencial): casi siempre son imperfectas. Análisis estadístico mediante Lod Score: Logarithm of the Odds (Log de la probabilidad) de que dos genes estén ligados. Idealmente se deben usar varias genealogías para incrementar la significancia. El análisis es menos problemático para familias con alto número de hijos y, preferiblemente, con tres generaciones disponibles.

Cómo se mide la distancia genética Dos loci: están ligados? Determinar la fracción de recombinación (θ) entre ambos loci: Si θ difiere significativamente de 0.5 implica ligamiento completo Si es igual a 0.5 implica desligamiento completo Determinar si una desviación de 0.5, si existe, es realmente significativa utilizando una herramienta estadística conocida como likelihood odds ratio: se examinan un grupo de datos familiares contando el número de hijos que muestran o no recombinación entre los loci. Se calcula la probabilidad de observar datos en varios valores posibles de θ variando entre 0 y 0.5. Se calcula la relación: Log10 Probab. de los datos si los loci están ligados : Lod Score (Z) Prob. de los dados si los loci no están ligados

Si Z <1 ==> pocas probabilidades de ligación Si Z > 1 ==> los loci están ligados Z ≥ + 3 ==> evidencia definitiva de que los loci están ligados

Ejemplo Ej. RP9: Retinitis Pigmentosa (D y d) Dos loci A y B 1. Se estudia transmisión en genealogía, D podría estar ligado a B, pero no a A. 2. Se determinan parentales y recombinates, y se calcula θ entre D y B. 3. Se calcula el Lod Score: 1.81. Conclusión: Hay ligamiento entre D y B y no entre D y A, pero se deben estudiar familias más grandes, más familias.

Dos tipos de familias pueden considerarse A- Un peq número de familias muy grandes. Tiene la ventaja de que todos los miembros afectados de este pedigree tienen la misma mutación en el mismo gen acarreada desde un punto inicial B- Gran número de familias peq. Es más facil de realizar, pero puede ser que no todas las familoias tiene un desorden idéntico ==> Heterogeneidad de locus: síntomas clínicos idénticos pero causados por 2 o meas loci geneéticos Heterogeneidad de locus: síntomas clínicos idénticos pero causados por 2 o más loci genéticos

El Proyecto Genoma Humano Secuenciación del genoma humano 1990-2003 (borrador), 2006 (secuencia final). Objetivos: Identificar todos los genes en el genoma humano. Determinar la secuencia de 3 billones de pb del genoma humano. Almacenar la información en bases de datos. Desarrollar y mejorar herramientas de análisis de datos. Análisis de la información del genoma (Expresión, Proteómica). Análisis de la información: Complejidad y Volumen: se requieren tecnologías a escala genómica para el análisis de datos, comparaciones con otros genomas, comparaciones entre familias génicas, etc.

Algunos puntos importantes Estudio de genomas: necesario la secuenciación. La secuenciación de moléculas de ADN tenía una limitación: fragmentos de ~ 750 pb. La secuencia de una molécula larga debía ser construida de una serie de secuencias más pequeñas. El método de escopeta (Shotgun method)

Método de escopeta

Dos limitaciones 1. El análisis de datos se vuelve extremadamente complejo conforme se incrementa el número de fragmentos (n fragmentos tienen 2n2-2n traslapes). 2. Secuencias repetitivas pueden generar errores. El método de escopeta como único método de secuenciación es apropiado sólo para genomas pequeños (procariotas). Para genomas grandes: generación de un Mapa Genético como guía.

PAC: One type of vector used to clone DNA fragments (100- to 300-kb insert size; average, 150 kb) in Escherichia coli cells. Based on bacteriophage (a virus) P1 genome

Utilidad del genoma: el reto de la Biología Determinar el número de genes, localización y función. Regulación génica. Organización de la secuencia del ADN. Estructura cromosómica y organización. Tipos de ADN no codificante, cantidad, distribución, contenido de información y función. Coordinación de la expresión génica, síntesis de proteínas y eventos post-traduccionales. Interacción de proteínas en máquinas moleculares complejas.

Utilidad del genoma: el reto de la Biología Función génica predicha vrs determinada experimentalmente. Conservación evolutiva entre organismos. Proteomas (contenido proteico total y función) entre organismos. Correlación de SNPs con salud y La Enfermedad. Predicción de susceptibilidad a enfermedades basada en variación en la secuencia. Genes involucrados en rasgos complejos y enf. Multigénicas. Genética y genómica del desarrollo.

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano? Algunos hallazgos: • El genoma humano contiene 3 mil millones (3 billones) de pares de bases (A, C, T y G) • Un gen consiste en promedio de 3000 pares de bases, pero los tamaños varían mucho • El número total de genes se estima alrededor de 30 000 --- mucho menor que las estimaciones previas de 80.000 a 140.000---- • Casi todas las bases (99,9%) de nucleótidos son exactamente las mismas en todas las personas • Las funciones son desconocidos para más del 50% de los genes descubiertos

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano? Presencia de regiones de genes densas (ricos en G y C), regiones de genes pobres (ricas en A y T ). Estas regiones suelen ser visibles a través de microscopio en forma de bandas claras y oscuras en los cromosomas. • Los genes parecen estar concentrados en áreas al azar a lo largo del genoma, con vastas extensiones de ADN no codificante entre ellos. • Repeticiones de C y G de hasta 30.000 pb a menudo se presentan junto a genes, formando una barrera entre los genes y el "ADN basura". Estas islas CpG se cree que ayudan a regular la actividad de los genes. • El cromosoma 1 tiene la mayoría de los genes y el cromosoma Y tiene el menor número How It's Arranged • The human genome's gene-dense "urban centers" are predominantly composed of the DNA building blocks G and C.   • In contrast, the gene-poor "deserts" are rich in the DNA building blocks A and T. GC- and AT-rich regions usually can be seen through a microscope as light and dark bands on chromosomes. • Genes appear to be concentrated in random areas along the genome, with vast expanses of noncoding DNA between. • Stretches of up to 30,000 C and G bases repeating over and over often occur adjacent to gene-rich areas, forming a barrier between the genes and the "junk DNA." These CpG islands are believed to help regulate gene activity. • Chromosome 1 has the most genes (2968), and the Y chromosome has the fewest (231). ¿Cómo lo arregló • gen del genoma humano-denso "centros urbanos" son en su mayoría compuesta de los bloques de construcción de ADN G y C. • En contraste, el gen de los pobres "desiertos" son ricos en los bloques de construcción de ADN A y T. GC - y en regiones ricas suelen ser visibles a través de un microscopio en forma de bandas claras y oscuras en los cromosomas. • Los genes parecen estar concentrados en áreas al azar a lo largo del genoma, con vastas extensiones de ADN no codificante entre. • Tramos de hasta 30.000 C y G bases de repetir una y otra vez a menudo se presentan junto al gen de las zonas ricas, formando una barrera entre los genes y el "ADN basura". Estas islas CpG se cree ayudan a regular la actividad de los genes. • El cromosoma 1 tiene la mayoría de los genes (2968), y el cromosoma Y tiene el menor número (231).

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano? • Menos del 2% del genoma codifica por proteínas • Secuencias repetidas que no codifican por proteínas, en al menos el 50% del genoma humano • Las secuencias repetitivas: se cree que no tienen funciones directas, sino que intervienen en la estructura y dinamica del cromosoma. Con el tiempo estas repeticiones remodelar la organización del genoma, creando nuevos genes, modificando y reorganizando genes existentes. • El genoma humano tiene mas cantidad de secuencias repetitivas que otros organismos como: planta de mostaza (11%), gusano (7%), la mosca (3%). The Wheat from the Chaff • Less than 2% of the genome codes for proteins.   • Repeated sequences that do not code for proteins ("junk DNA") make up at least 50% of the human genome. • Repetitive sequences are thought to have no direct functions, but they shed light on chromosome structure and dynamics. Over time, these repeats reshape the genome by rearranging it, creating entirely new genes, and modifying and reshuffling existing genes. • The human genome has a much greater portion (50%) of repeat sequences than the mustard weed (11%), the worm (7%), and the fly (3%).

Organismo Tamaño genoma (pb) Genes estimados Humano (Homo sapiens) 3 billion 30,000 Ratón (M. musculus) 2.6 billion Planta de Mostaza (A. thaliana) 100 million 25,000 Nemátodo (C. elegans) 97 million 19,000 Mosca de la fruta (D. melanogaster) 137 million 13,000 Levadura (S. cerevisiae) 12.1 million 6,000 Bacteria (E. coli) 4.6 million 3,200 Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) 9700 9

Algunos animales cuyos genomas ya han sido secuenciados

An NIH program to chart genetic variation within the human genome HapMap An NIH program to chart genetic variation within the human genome • Iniciado en 2002, el proyecto para construir un mapa de los patrones de SNPs que se producen en las poblaciones de África, Asia y los Estados Unidos Consorcio de investigadores de seis países Identificación de las regiones de ADN asociados con enfermedades complejas comunes Mapa útil para comprender cómo la variación genética contribuye a las respuestas en los factores ambientales

Beneficios Potenciales de la Investigación Genómica Medicina Molecular Genética Microbiana Evaluación de Riesgos y Susceptibilidad Bioarqueología, Antropología, Evolución y Migración Humana Estudios forenses Agricultura, Ganadería y Bioprocesos

Implicaciones éticas, legales y sociales Privacidad y confidencialidad de la información genética Dueños del genoma??? Patentes La equidad en el uso de la información genética. Ej: aseguradoras, patronos, tribunales de justicia, escuelas, agencias de adopción, abogados, militares, entre otros El impacto psicológico, la estigmatización y la discriminación debido a las diferencias genéticas de un individuo Reproducción: el consentimiento informado, toma de decisiones en materia reproductiva Clínica: la formación de los médicos y otros proveedores de servicios de salud, control y seguimiento de personas identificadas con trastornos genéticos y en general acerca de las capacidades, limitaciones y riesgos sociales.