PCR: Manejo de muestras y aplicaciones Laboratorio de Patología Molecular Departamento de Anatomía Patológica

Introducción ALTERACIONES GENETICAS PUNTUALES CROMOSOMICAS PCR (Polimerase Chain Reaction) FISH (Fluorescent in situ Hybridization)

Estructura del DNA Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre sí, como si fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada vagón con el siguiente. Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando solo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la información genética.  se clasifican en dos grupos: las bases púricas o purinas (adenina y guanina), derivadas de la purina y formadas por dos anillos unidos entre sí, y las bases pirimidínicas o bases pirimídicas o pirimidinas (citosina y timina), derivadas de la pirimidina y con un solo anillo.  A=T forman dos puentes de hidrógeno, y C≡G forman tres puentes de hidrógeno 

Replicación del ADN El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "réplicas" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservador, lo que indica que los dos polímeros complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la s. La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias puntos determinados: los orígenes de replicacióníntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde. Intervienen un gran número de proteínas. https://es.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-replication/a/molecular-mechanism-of-dna-replication http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm

Fundamentos de la PCR  La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN. Multiplica/Amplifica el número de copias de una región de interés para que las posibles alteraciones puedan ser detectadas por las distintas plataformas de análisis. Basándonos en este proceso natural en la biología de las células, la PCR. Lo que permite la PCR es amplificar la región que potencialmente puede tener una alteración para que las plataformas de análisis puedan detectarla.

Limitaciones en cantidad y calidad del ADN/ARN Material de partida DNA de FFPE DNA de Citologías Biopsia líquida (DNA tumoral ciruclante, ctDNA) Sangre periférica Limitaciones en cantidad y calidad del ADN/ARN DNA muy fragmentado y dañado por la fijación con formol (¡falsos positivos!) Nos vamos a centrar en el material de partida del que disponemos normalmente en los departamentos de Anatomía Patologica.

Extracción de DNA FFPE Corte (Microtómo) de 2-4 secciones de 10 µm de grosor. Uso de guantes. Descontaminación de microtómo/ lancetas entre bloques. Cambiar zona cuchilla entre bloques Empleo de tubos estériles para recoger el tejido. 1. Desparafinar: Xilol/Alcohol/Solución Comercial 2. Digerir: Digestión del tejido con proteinasa PRECAUCIONES: Usar guantes Descontaminación pipetas/superfícies Cambio de puntas entre muestras

Extracción de DNA FFPE 3. Extracción: Kit comercial. Elución en H2O/Elution Buffer (EB) 4.Cuantificar: Medir la concentración de ADN obtenido PRECAUCIONES: Uso de blanco (¿contaminación?) Usar guantes Cambio de puntas entre muestras

Extracción de ctDNA de sangre Plasma Extracción de cfDNA Sangre completa Extracción de 10 mL de sangre usando tubos Streck Cell-Free DNA BCTR (blood collection tube). Separación del plasma: ≤ 3 días desde la extracción hasta la separación. Si no se va a proceder con el aislamiento del ctDNA, congelar a -70ºC en criotubos. Almacenar DNA a 2 to 8°C (cuando se continúa en 24h) o a – 15 to – 30° cuando se continúa después de 24h).

Componentes H2O/ EB DNA polimerasa Cebadores dNTPs Cond. químicas (tampón, reactivos) Cond. térmicas (termociclador) http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html

Etapas http://missinglink.ucsf.edu/lm/molecularmethods/pcr.htm

A tener en cuenta: Zonas PRE-PCR y POST-PCR SEPARADAS Descontaminación de superfícies y pipetas (Hipoclorito de Sodio 10% + Etanol 70% + DNA decontaminator) Incluir un exceso en la preparación de la mix (errores de pipeteo) Incluir siempre: control de PCR (+/-) control negativo (¿contaminación?)

Electroforesis en gel de agarosa PCR CONVENCIONAL Electroforesis en gel de agarosa DNA AMPLIFICADO Mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos Conlleva posterior empleo de otras técnicas para la visualización de los resultados

Secuenciación Sanger Next Generation Sequencing Citómetría de flujo Pirosecuenciación Análisis de fragmentos

PCR A TIEMPO REAL Permite la amplificación del DNA y la detección y cuantificación de la mutación en tiempo real Adición de una sustancia marcada con fluorescencia.  El termociclador debe contener sensores para medir la fluorescencia generada de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza después de cada ciclo de amplificación (de ahí que se llame ‘en tiempo real’)

Laboratorio de Patología Molecular PCR en tiempo real PCR convencional FISH Pirosecuenciación Next Generation Sequencing Secuenciación Sanger Citometría de Flujo AKT1, ALK, APC, BRAF, CDH1, CTNNB1, EGFR, ERBB2, FBXW7, FGFR2, FOXL2, GNAQ, GNAS, KIT, KRAS, MAP2K1, MET, MSH6, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, SMAD4, SCR, STK11,TP53, RET, ROS-1…

Aplicaciones These markers can be used to forecast the likely response to a specific treatment These markers can be used to estimate the likely course of disease irrespective of treatment Prognostic Markers (recurrence risk) Predictive Markers (treatment benefit) Buyse M et al. Nature Rev 2010

The genetic basis for cancer treatment decisions Garraway, LA. J Clin Oncol 2012

Mensajes Finales La técnica de PCR es la base de determinaciones moleculares (junto con la técnica de FISH) Su uso en Oncología médica está enfocado al uso de terapias dirigidas, determinando alteraciones en biomarcadores diana Requiere de pulcritud y rigurosidad para evitar contaminaciones cruzadas entre las distintas muestras Precisa de un equipo multidisciplinar cualificado para su realización y posterior interpretación (técnicos especialistas, biólogos y patólogos) Además, es la base de técnicas más complejas como la Next Generation Sequencing, gracias a la cual pueden encontrarse nuevos biomarcadores potencialmente accionables (ensayos clínicos).

Laboratorio de Patología Molecular (Anatomía Patológica, FJD)